BioCheck，Inc。为医疗保健市场和研究市场开发，制造和分销免疫诊断检测试剂盒和研究试剂。
我们的新产品包括用于研究应用的兔单克隆抗体，用于小鼠和人类Id1，Id2，Id3和Id4蛋白，抗体用于HMGA2的研究应用。
BioCheck pd-1酶免疫测定试剂盒说明书
PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT
pd-1酶免疫测定试剂盒
Enzyme Immunoassay for the Quantitative Determination of PD-1 Concentration in Human Serum and Plasma
酶免疫法定量测定人血清和血浆中Pd-1浓度
目录编号：bc-1301
只作研究用途，而非用于诊断程序。
介绍
程序性细胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一种细胞表面受体，对调节T细胞炎症活动和维持外周免疫耐受至关重要。 系统(1)。pd-1可以与配体pd-l1和pd-l2相互作用。pd-1具有胞外IGV结构域、跨膜结构域和带有两个磷酸化位点(shp-1和shp-2)的胞内尾。 下调免疫系统，抑制T细胞活性(2)。抗原识别后，活化的T细胞在其表面表达pd-1，产生干扰素，诱导P的表达。 d-L1，从而促进细胞凋亡或细胞死亡。(3)当pd-1配体被肿瘤细胞劫持时，其异常表达抑制了免疫调节T细胞的活化，导致疾病进展。 <物>离子 (4).
血清和血浆中Pd-1水平升高与类风湿关节炎和皮肤硬化有关(5，6)。Pd-1主要由肿瘤浸润的T细胞(7)表达.进一步再 研究表明，使用针对pd-1免疫检查点的单克隆抗体有助于在理解和治疗黑色素瘤和其他内翻等癌症方面取得突破性进展。 非小细胞肺癌(4)。
测定原理
pd-1酶联免疫吸附试验是以固相酶联免疫吸附试验为基础的.该检测系统利用一种*的单克隆抗体对，针对一种*的抗原性测定方法。 Pd-1分子上的蚂蚁。用一种小鼠抗PD-1单克隆抗体进行固相固定(在微滴度井上).另一种与辣根结合的单克隆抗pd-1抗体 H过氧化物酶(HRP)存在于酶的共轭溶液中。测试样品被允许与这两种抗体顺序反应，导致pd-1分子被夹在固体p之间。 Hase和酶联抗体。在室温下进行两次单独的60分钟孵育后，用洗涤缓冲液冲洗水井，除去未结合的标记抗体。TMB试剂添加了一个 ND在黑暗条件下孵育20分钟，形成蓝色。随着停止解决方案的添加，颜色开发停止，将颜色更改为黄色。这，这个，那，那个 Pd-1浓度与样品的显色强度成正比.在450 nm处分光度法测定吸光度。
试剂准备
所有试剂在使用前应允许达到室温(18-25°C)。
2.对于每次测试运行，准备一个新的标准集。
3.用标准/样品稀释剂稀释50~10 ng/mL。用标准/样品稀释剂制备10 ng/mL标准的双倍系列稀释剂：
a.10 ng/mL：0.12mL 50 ng/mL，0.48mL标准品/样品稀释剂b。5 ng/mL：0.25mL 10 ng/mL标准品/样品稀释剂c。2.5纳克/毫升：0.25毫升5纳克/毫升标准品/样品 稀释剂d.1.25 ng/mL：0.25 mL，2.5 ng/ml，0.25 mL标准品/样品稀释剂e。0.625 ng/mL：1.25ng/mL标准品/样品稀释剂f的0.25ng/mL。0.313 ng/mL：0.25mL，0.625 ng/mL 0。 25 mL标准/样品稀释剂
h.0.156 ng/mL：0.25mL，0.313 ng/mL，0.25mL标准稀释剂I。0 ng/mL：0.25 mL标准稀释剂
病人样本在使用前需要稀释4倍。制备一系列小管(即1.5 mL微离心管)，将60L血清与180 L标准/样品稀释剂混合。
6.工作洗涤缓冲器：从20倍库存中制备1倍洗涤缓冲液。加入50毫升的20倍洗涤缓冲液库存到950毫升的直接水。工作洗涤缓冲液在2~8°C温度下稳定运行30天.注：任何水晶 由于高盐浓度而可能出现的S，必须在室温下重新溶解，然后再进行稀释。
检测程序
准备标准。见试剂准备。
稀释样品1：4稀释。见试剂准备。
确保所需数量的涂层井在保持架。
配发Pd-1标准的100mL，并将样品稀释到适当的井中.
室温(18-25°C)孵育60 min.
将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸水性纸或吸尘器上。 用毛巾去除所有残留的水滴。
将Pd-1工作酶结合剂的100mL配伍到每口井中.
8.室温(18-25°C)孵育60 min.
9.将培养皿中的内容物倒入废容器中，将孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗缓冲液冲洗微滴水井5次。把水井打到吸收纸上或 纸巾去除所有残留水滴。
10.在每口井中分配100mL TMB溶液。
11.室温(18-25°C)孵育20分钟.
12.通过在每口井中加入100mL的停止溶液来停止反应。
13.轻轻搅拌30秒。重要的是要确保所有的蓝色*变成黄色。
14.在450 nm处读取吸光度，15分钟内使用微滴度良好的阅读器。
统计
计算每组参考标准、对照和样品的平均吸光度值(OD 450)。
通过绘制每个参考标准的平均吸光度(以纳克/毫升为单位)绘制在图表纸上，并在垂直(Y)轴上绘制吸光度，从而构造一条标准曲线。 在水平(X)轴上的比率。
用每个样品的平均吸光度值，从标准曲线上测定相应的Pd-1浓度(ng/mL)。取决于经验和/或计算机的可用性 能力，可以采用其他的数据缩减方法。
4.样品的检出值应乘以稀释倍数为4，得到Pd-1的结果为ng/ml。
标准曲线实例
一个典型的标准运行结果，吸光度读数在450 nm处显示在Y轴上，而pd-1浓度显示在X轴上。注：本标准曲线为图示目的。 仅用于计算未知数，不应用于计算未知数。每个实验室必须在每个实验中生成自己的数据和标准曲线。
工作特性
从零标准的平均值用2SD法测定的Pd-1ELISA低可检出浓度为0.15ng/ml。
精度a.在一次测定中，通过对三种不同样品的重复测定，确定了内测精密度.批内可变性如下所示：
b. 在一系列单独校准的测试中，通过对三个不同样本的重复测量，确定了运行间精密度。试验间的可变性显示为贝尔。 表示突然疼痛所发出的声音
3、回收率和线性研究。回收样品加入已知的Pd-1水平，并一式两份进行测定。平均回收率为105.3%。
b.对三个样品进行连续稀释，以确定线性度。平均回收率为99.6%。
REFERENCES
7. Ahmadzadeh, M., Johnson, L. A., Heemskerk, B., Wunderlich, J. R., Dudley, M. E., White, D. E., & Rosenberg, S. A. (2009). Tumor antigen–specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood, 114(8), 1537–1544
