phiphilux泛毒素

概述

泛毒素^™ 是 OncoImmunin,Inc. 新的基于活细胞的试剂盒，用于测量细胞毒性淋巴细胞打击的致死物成功递送到单个靶细胞。该试剂盒用于具有双激光（488 和 633 nm）细胞计数能力的 80 次测定。（对于单激光系统，请联系 OncoImmunin,Inc.直接。）

泛毒素^™ 与格兰毒素^®加！和CyToxiLux^®加！、OncoImmunin,Inc. 的其他单细胞毒性检测试剂盒，区别在于细胞渗透性、荧光底物：泛毒素^™ 含有可检测两者颗粒酶 B 和上游半胱天冬酶活性，而底物在格兰毒素^® 旨在仅检测颗粒酶 B 活性，并在CyToxiLux^® 下游半胱天冬酶活性。与其他两个套件一样，泛毒素^™ 可用于操作抗体的选择通过an 抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)低通量和高通量筛选 (HTS) 模式下的机制。

优点泛毒素^™, 格兰毒素^®和CyToxiLux^® 超过其他细胞毒性试验，例如，⁵¹Cr 释放、LDH 释放和 PI 包括：(1) 细胞毒性作为导致细胞死亡（细胞渗透性荧光底物裂解）的基本生化途径进行测定，而不仅仅是质膜渗透性损失及其后遗症，(2) 敏感性增强，可检测到针对亚优势表位的相对较弱 CTL 反应 (3) 快速性（效应子：目标共孵育时间为 0.3-2 小时），(4) 可通过流式细胞术或荧光显微镜仅在靶细胞群中进行细胞死亡测定，(5) 结合免疫表型分析和多参数流式细胞术时，可直接观察和监测细胞毒性淋巴细胞介导的主要宿主靶细胞杀伤以及效应细胞的生理和命运。

靶细胞被荧光标记（红色）然后在有荧光的情况下与细胞毒性效应细胞共孵育底物。孵育和清洗后，可通过流式细胞仪分析样本。裂解底物  导致死亡细胞中绿色荧光增加。实时成像也可以用共聚焦显微镜进行。

请在开始试验前阅读整个方案！

组件供应泛毒素^™ 试剂盒（足够用于 80 含量测定） 由以下机构提供的组件 使用者

小瓶 PS（4 瓶）=PanCyToxiLux^™ 底物 溶液 效应子 细胞

小瓶 TFL4（1 瓶）=靶细胞与双激光仪器配合使用的标记物 TFL 稀释介质（1 个小 Eppendorf 管）= 重悬介质

针对小瓶 TFL4

靶细胞

清洗缓冲液瓶（1 瓶）

为了从起始靶细胞群中消除非活细胞，例如，由于冻融循环，请联系 OncoImmunin,Inc.请注意：用荧光探针标记细胞表面是不推荐，因为这可能干扰效应物-靶标相互作用。当按照本文中的程序使用时，TFL4 确实不标记细胞表面。

格式：可使用 96 孔板或聚丙烯微量离心管进行试验。

TFL4 的复溶：从小 Eppendorf 管中取 25<unk>l 加入小瓶 TFL4。（复溶后，TFL4应储存在-20^oC.)

中 T= 标记靶细胞的培养基。复溶溶液 1<unk>lTFL4加入靶细胞生长的培养基或生理缓冲液如磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。请注意：大多数细胞在 PBS 或不含血清的培养基中负荷更有效。如含 10% 血清，推荐TFL4稀释度为 1:1000，而对于无血清缓冲液，靶细胞标记通常用于1:3000但是，进一步稀释可能更优。宜TFL4单个靶细胞类型的浓度应确定为 1:1000（含血清）和 1:3000（无血清培养基）仅为建议的起始点。

洗涤定义为加入体积的培养基/缓冲液，然后离心，然后小心移除试管中的所有液体或轻弹，然后轻轻夯实平板。应使用手指轻轻移液和/或轻敲试管，重悬微丸。请勿涡旋.

方案

制备靶细胞

1. 悬浮靶细胞（悬浮或胰蛋白酶化贴壁细胞）于中 T在 2 x 10⁶细胞/ml。（这是建议的浓度。可以并常规使用较低的数字。临界点是能够收集到 2,000-10,000  分析用靶细胞（见下文）。）如果要用增敏剂（如多肽）冲击靶标，则应在此阶段加入后者。（如果肽溶解度需要使用有机助溶剂，后者不应超过 0.3% (v/v)，且 溶媒

207A Perry Parkway,Suite 6 V: 301-987-7881 cytotoxicity@PhiPhiLux.com

Gaithersburg,MD 20877 F: 301-987-7882 www.cytotoxicity。。ｃｏｍ

应包括对照管/孔。）在 37 ℃ 下孵育^oC 下 0.25-1.0 小时。应确定单个细胞类型（和致敏剂）的宜时间。请注意：对于 PBL 的上样，1:1000 稀释TFL4在 37℃PBS 中 15'^o建议使用 C。如果要将多肽与靶标一起使用，建议是添加TFL4对于后 15’ 的致敏剂暴露。

1. 在此期间，制备效应细胞（见下文）。
2. 清洗靶细胞2 次，至少超出生理体积的 10 倍每次清洗的缓冲液/培养基.
3. 标示计数靶细胞。（此时必须对细胞进行计数，因为清洗时始终存在细胞损失。）重悬标记靶细胞在 1 x 10 下⁶细胞/ml清洗缓冲液。（根据实验设计，较低浓度的靶细胞可使用。1 x 10⁶对于 1 x 10 的情况，建议使用 cells/ml⁵ 目标/孔或  管将为 使用。）
4. 分配 100<unk>l靶细胞混悬液加至各试验孔或试管中。

效应细胞的制备

1.  制备适当浓度的效应细胞清洗缓冲液.   例如，对于终效应者目标比值  的 5:1，其中 1 x 10⁵ 目标/孔或管将使用，以 5 x 10 悬浮效应细胞⁶ 细胞/ml。

共孵育目标和效应细胞

1. 向各孔或含以下物质的试管中加入 100<unk>l 效应细胞悬液靶细胞除外至少两个孔，并加入 100

<unk>l 效应细胞悬液至至少两个不含靶细胞.

1. 加入 100<unk>l清洗缓冲液至仅含目标且仅效应物使所有样品达到终体积 200<unk>l.
2. 离心所有样品，小心移除培养基，并将细胞团块重悬于 75<unk>l 中底物来自小瓶 PSor 清洗缓冲液对于对照品（不存在底物（适用于以下管 A 和 C）。对于 ADCC，抗体应添加至  这次。
3. 重悬后，立即通过短暂离心沉淀细胞（一旦离心机达到细胞正常使用的速度，保持 30 秒，然后停止仪器。）
4. 在 37 ℃ 下孵育^oC 为所需时间点。由于该试验检测的是濒死细胞，而不是具有不可逆损伤质膜的细胞，因此给定细胞系统的孵育时间（以及 E:T）应显著短于（和低于）其他方法。对于单个时间点测定，建议的共孵育时间为 1 小时（终端用户时间通常在 30 min 至 2 小时之间）。相当长的时间不会 推荐。
5. 用 200<unk>l 清洗各样品清洗缓冲液.
6. 重悬各样品清洗缓冲液，如果使用酶标仪，转移至流式细胞仪试管中或留在平板中，并通过流式细胞仪进行分析。

样品总结：

1. 靶细胞（= 靶细胞 TFL4）
2. 靶细胞+ 底物来自小瓶 PS
3. 效应细胞
4. 效应细胞 +底物来自小瓶 PS
5. 靶细胞+ 效应细胞 +底物来自小瓶 PS（多个样本）

流式细胞术：请勿涡旋。  (N.B.：由于本试验测量的是致死打到靶细胞涡旋  强烈建议不要使用。）

应使用与以下激发和发射峰一致的通道设置：

TFL4l_ex: 633 nm, l_em: 657 nm

PS l_ex: 488 nm, l_em: 520 nm

对于为特定探针设置软件的仪器：APC针对TFL4和FITC针对PS.

1. 在 FSC 点图上（x 轴）vs. SSC（y 轴），位置靶细胞（样本 A）位于右下方并抽取门控 1如下所示（此门控用于删除无细胞事件）：

1. 使用样品A 和D 初始设置APC（用于TFL4）和FITC（用于泛毒素^™）通道，resp.：放置样品中细胞的峰值A 接近 10³在APC通道和样品峰D at ca. 10¹在FITC通道。样品 B 中的细胞应位于ca. 10³在APC和 10¹在FITC通道，如下所示。可通过样品 B 的 PMT 小幅调整进行优化（注：健康（台盼蓝拒染法显示 > 95% 活性）TFL4-标记靶细胞应显示为单一群体。如果不是，首先尝试将贴标时间缩短至 15 min。如果仍存在一个以上的种群，则减少TFL4 浓度。）

运行剩余样本。2,000-10,000靶细胞应采集每份样本进行分析门 2（上图和下图）。门 2应嵌套在内部门控 1。在以下 E:T (NK92:K562) 为 3:1 的示例中，能够裂解 PanToxiLux 的靶细胞百分比^™底物is 70.3%。这与 4.8%靶细胞单独的背景（如上图所示）。请注意：使用 NFL1（OncoImmunin,Inc. 提供的探针）可显著降低该背景。需要带有 PacBlue 通道的细胞仪（激发ca. 405 nm 和发射ca. 465 nm).

参考文献泛毒素™

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