FORTEBIO的生物逻辑

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FORTEBIO 抗人 IgG 捕获 (AHC) 生物传感器

抗人 IgG 捕获 (AHC) 生物传感器

-动力学等级

用于蛋白结合产物无标记检测的 Octet 生物传感器代码：18-5060，18-5061

开始试验前，请完整读取整个产品说明书。仅供研究使用，不用于诊断程序。

O 垂直

抗人 IgG 捕获 (AHC) 生物传感器能够将人 IgG 或其他含有人 Fc 区的蛋白固定在生物传感器表面。固定化蛋白可用于后续的动力学相互作用分析。事件  AHC 生物传感器的表面设计为提供稳定的相互作用，使其适用于苛刻的动力学应用。

  INTE 编号US E

ForteBio 抗人 IgG 捕获 (AHC) 生物传感器，结合 Octet QK 系统或 Octet RED 系统，设计用于大分子相互作用的动力学分析。AHC 生物传感器可用于许多样品类型，包括纯化蛋白、细胞培养上清液和细胞裂解物。

  P RI NCI PL E

使用抗人 IgG Fc 部分的高亲和力抗体预固定抗人 IgG 捕获 (AHC) 生物传感器。该抗体可捕获并固定人 IgG (hIgG) 或其他含 Fc 配体，以产生适用于相互作用分析的稳定表面。捕获表面特别适用于固定细胞培养上清液或其他复杂混合物中的 hIgG，其中生物素化不是一个选择。

AHC 生物传感器经设计可耐受典型再生条件。在典型工作流程中，这允许捕获目标 hIgG，分析人 IgG 与其分析物的结合，然后表面再生至其原始状态。然后可以通过加载新的人 IgG 重复使用生物传感器。

K I T C 打开

Octet QK 和 Octet RED 系统的抗人 IgG 捕获生物传感器包含：

将生物传感器储存在室温下的干燥处，避免阳光直射。将生物传感器作为锐器处置。收到后，生物传感器可稳定储存 6 个月。

10x 动力学缓冲液-10 mM 磷酸盐、150 mM NaCl、0.02% 吐温 20、0.05% 叠氮化纳、1 mg/mL BSA (pH 7.4)。在 2-8 ℃ 下储存直至失效。

  A DDITIO 编号M后结果R 等效 E D

需要以下附加材料：

• 人 IgG-可固定人 IgG 或其他含人 Fc 的蛋白。人 IgG 可以是纯的，也可以是复杂混合物（如培养物上清液）的一部分。
• 调节/再生溶液-10 mM 甘氨酸 pH 值

表面处理和再生需要 1.7。根据固定分子，可能需要进一步优化 pH 值。

• 相互作用蛋白
• 试验缓冲液-推荐 1X Kinetics 缓冲液（用 PBS (pH 7.4) 以 1:10 稀释 10X Kinetics 缓冲液）。可使用其他缓冲液。在整个生物传感器水合和所有测定步骤中，缓冲液保持一致时观察到的结果。
• Octet QK 系统或 Octet RED 系统
• 96 孔微孔板-2 X 96 孔、黑色平底聚丙烯微孔板 (Greiner Bio-one#655209)

T EC HN IQUE SFO RO PTIMA LP ER FO RM AN CE

1. 在加载步骤之前，需要对生物传感器进行调节，以改善基线和表面稳定性。通常调节包括 3 X 20 秒暴露于再生缓冲液和 1X 动力学缓冲液交替。
2. 对于严格的应用，建议使用由结合和再生循环组成的生物传感器表面的“主要”。该预充结合循环应包括从溶液中捕获 hIgG，然后使用再生方案再生回原始表面。应在表面处理后进行预充。
3. 通常，生物传感器表面的再生可以通过 5 X 5 秒暴露于 10 mM 甘氨酸 pH 1.7 与 1X 动力学缓冲液交替实现。在某些情况下，可能需要根据 hIgG 进一步优化再生。
4. 为了获得良好性能，应包括一个参考生物传感器。参比生物传感器应加载 hIgG，并应使用用于结合和解离步骤的缓冲液空白运行。
5. 制备前，将试剂和样本平衡至室温。对于冷冻样本，使用前解冻并充分混合。
6. 在 Octet 系统上进行测定前，需要对生物传感器进行水合。生物传感器在与整个试验过程中使用的缓冲液一致的缓冲液中水合将得到稳定的结果。
7. 检测样本和生物传感器水合溶液所需的小体积均为 200 μL/孔。
8. 确保 Octet 仪器打开，并在开始测定前将灯预热至室温至少 40 min。
9. 选择文件 <unk>，在 Octet 软件中设置样品板温度 实验 <unk>  设置板温度。输入  所需温度。ForteBio 建议测定  在 30 °C 下测定。在其他温度下测定可能需要与本方案中讨论的不同的测定时间。

  P RO 至 CO LO 垂直

1. 制备缓冲液、再生溶液、配体和相互作用的蛋白样品。
2. 移取 200 μL 适当的水合溶液，置于 96 孔板中。将水合板插入，然后将生物传感器置于生物传感器托盘上，以水合生物传感器。
3. 将 200 μL 各适当样品或缓冲液转移至 96 孔板的适当孔中。
4. 在 Octet 仪器上平衡水合生物传感器组件和样品板 10 min。
5. 开始试验。
6. 进行数据分析并保存结果。

  S AMPL EP RE PA RA TI ON

制备前将试剂和样本平衡至室温，并充分混合。

1. 人 IgG 或其他含 Fc 配体– 配体是固定在生物传感器表面的蛋白质。含 Fc 配体的典型固定浓度为 5-25µg/mL。每个孔需要 200µL 配体。试验后可从微孔中回收配体溶液，并根据需要重复使用。

如果从细胞培养上清液中捕获配体，如果用 1X Kinetics 缓冲液将上清液以至少 1:2 稀释，则可获得宜结果。如果该稀释导致配体的总浓度较低，则生物传感器可与细胞培养物在 4 C 下孵育过夜，以使含配体的 Fc 的上样量大化。关于过夜装载的提示，请参见  技术说明TN3010_ 链霉亲和素批次固定.

1. 相互作用蛋白-在严格的动力学分析期间，建议运行至少 4 种不同浓度的

   以稀释系列形式相互作用的蛋白质。高浓度应比预期 KD 高约 10 倍。例如，对于预期具有低 nM 亲和力的相互作用，相互作用蛋白的浓度 90 nM、30 nM、10 nM 和 3 nM 通常可提供良好的动力学数据。每份样品需要 200µL 蛋白溶液的微孔体积。

   对于筛选试验或定性相互作用分析，相互作用蛋白的单一浓度足以表征结合。

2. 调节/再生溶液-抗人 IgG 捕获生物传感器可通过使用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 再生至捕获表面水平。再生后，生物传感器可重新加载 hIgG，用于新的相互作用分析。在重复再生中观察到结合力的小幅损失。为了稳定表面，建议执行初始调节步骤。该调节包括在*相互作用试验前将生物传感器暴露于再生缓冲液。

3. 对于分析的特定 hIgG/相互作用蛋白，可能需要进一步优化调节/再生溶液的 pH 值。

   O 尼龙 EIMMOBILIZATIO NP RO 至 CO L

   以下是在线固定中使用的典型检测步骤列表。这些步骤由 Octet 系统*自动化。

4. 基线（通常为 1X 动力学缓冲液或培养基样品）
5. 处理（推荐）。将生物传感器暴露于再生溶液，以优化基线性能并稳定面密度。
6. 预充绑定循环（可选）
7. 配体上样（通常为 1X 动力学缓冲液或培养基样品）
8. 基线（通常为 1X 动力学缓冲液）
9. 相互作用蛋白的关联（通常为 1X 动力学缓冲液）
10. 解离（通常为 1X 动力学缓冲液）
11. 再生（10 mM 甘氨酸，pH 1.7）

12.  

13. 试验准备 - 按照上述样品制备章节所述，制备缓冲液、再生溶液、配体和相互作用蛋白。

14.  

15. 测定板 - 根据表 1 中的微孔板分布图，将 200 μL 各检测试剂转移至 96 孔黑色平底聚丙烯微孔板中。

16.  

    	1	2	3	4	5	6	7
    A	缓冲液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	缓冲液	hIgG 或 Fc-配体	缓冲液	相互作用蛋白	缓冲液
    B	缓冲液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	缓冲液	hIgG 或 Fc-配体	缓冲液	相互作用蛋白	缓冲液
    C	缓冲液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	缓冲液	hIgG 或 Fc-配体	缓冲液	相互作用蛋白	缓冲液
    	… …	…	…	…	…	…	…
    H	缓冲液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	缓冲液	hIgG 或 Fc-配体	缓冲液	缓冲液	缓冲液

    表 1.接骨板分布图示例。

     

    生物传感器水化板制备-小心地从生物传感器托盘组件上取下黄色生物传感器架的顶部，并放置在工作台上。将黑色 96 孔板牢固地放置在蓝色生物传感器托盘支架中。将 200 μL 水合溶液转移到微孔板中与正在使用的生物传感器的数量和位置相匹配的每个孔中。高度

    建议在整个试验过程中使用的相同缓冲液中水合生物传感器。

     

    将生物传感器架与水合板对齐，更换生物传感器架，注意不要刮擦或接触生物传感器底部。至少水合生物传感器至关重要10 min在 Octet QK 系统或 Octet RED 系统上。

17. 生物传感器和样品板的仪器放置-将带有 A1 的样品板朝向 Octet QK 仪器或 Octet RED 仪器中样品板载物台的右后角放置。

18. 将生物传感器托盘放在 Octet 仪器左手侧的生物传感器平板台上。

    确保生物传感器托盘和样品板均牢固就位。进入“仪器准备和编程”。

      I结构 TPRE pa RA TI Ona daP RO GR AM IN G

    确保 Octet 仪器及其计算机已打开。必须将灯预热至少 40 min。

    双击 Octet User Software 图标     并允许 Octet 完成初始化。从菜单中选择实验

    è    新   动力学  实验  (Ctrl + K) . 按照以下顺序填写每个选项卡所需的信息：

     

        传感器 <-> 样本分配

19. 使用鼠标突出显示生物传感器板中使用的传感器（方块）。传感器信息可直接输入表格。
20. 使用鼠标突出显示含有样本或试剂的孔。可将样本信息直接输入表格。
21. 输入相互作用蛋白的浓度值。
22. 点击“+“或“添加”执行测定所需的测定步骤数。
23. 定义每个测定步骤。
    1. 在“数据名称”下，双击更改步骤名称
    2. 分析时间
    3. 在“流速”项下，输入轨道流量振荡器的 rpm。所有动力学步骤（基线、缔合和解离步骤）均应在 1000 rpm 流速下进行。
    4. 在“类型”下，从下拉菜单中选择步骤类型。
24. 通过按应执行的顺序分配生物传感器、样本及其相关试验步骤，创建试验方案。
    1. 点击包含您希望使用的生物传感器的列，选择生物传感器列。
    2. 从以下选项中选择个定义的测定步骤步骤数据设置单击该表。

25. 双击选定步骤中要使用的样品列。该步骤将显示在“检定系统设置列表”中

     

        检测定义

    在表 2 中，“步骤数据设置”是带有相关参数的可编程步骤的示例列表。下表列出了典型检测的步骤顺序。

    如果运行启动结合循环，则在上样含配体的人 IgG 或 Fc（步骤 9）后，通过 5 次再生循环再生生物传感器。启动后，生物传感器应重新加载含配体的人 IgG 或 Fc，并从步骤 8 开始运行试验。

1. 在选择下一列生物传感器之前，完成剩余试验步骤。

表 2.检测步骤和相关参数示例。再生后，重复步骤 8-22 以重新加载并进行下一次试验。* 在 Octet QK 上，使用 Regen 步骤类型。在 Octet RED 上，使用自定义步骤类型。

    运行实验

1. 选择浏览按钮，保存原始数据的位置。强烈建议将数据保存到本地驱动器 (C:/)。运行完成后，可将数据传输至网络驱动器。
2. 输入实验运行名称（子目录），其为所有原始数据文件和与实验相关的实时绑定图表创建一个新文件夹。  如果默认名称不可接受，输入板名称。
3. 勾选“延迟实验开始框”。输入 300 秒，使样品达到测定温度所需的平衡时间为 5 min。
4. 默认设置将确保自动保存运行时图表。
5. 点击开始试验.