aatbio钙：通用信使

aatbio基于细胞的钙通量测定法广泛用于高通量筛选（HTS）中，以通过G蛋白偶联受体（GPCR），大量完整的膜蛋白家族和药物中的重要靶点类别确定激动剂刺激和拮抗剂抑制的信号传导发现。准确测量细胞内钙的浓度和动员可以更全面地了解钙调节的信号传导途径，细胞功能和病理过程。

AAT Bioquest已开发的钙指标，包括大的集合的Fluo-8 ^®，卡尔-520 ^®，和Calbryte™钙指标，以及，钙流测定法来跟踪动员激烈的荧光信号和在各种波长选择钙从紫外线到红外线。

aatbio钙：通用信使

钙是一种普遍存在的信使，会影响许多信号转导途径，包括钙诱导的蛋白质确认变化，细胞溶质和细胞器钙水平的调节，钙介导的信号转导的高度局限性及其在兴奋性，胞吐作用，运动性中的特定作用。 ，凋亡和转录。这些途径调节许多关键的细胞过程，包括神经传递，细胞增殖和肌肉收缩。在正常条件下，相对于细胞外液，钙的静息细胞质浓度相对较低（约100 nM）。钙信号传导是通过从细胞内储存物中释放钙离子，或通过质膜离子通道流入细胞外钙而激活的。受刺激的细胞可将细胞质钙浓度增加至500至1000 nM。

定量胞浆钙

显示结合钙后光谱响应的荧光指示剂使研究人员能够通过使用荧光显微镜，流式细胞仪，荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离钙浓度的变化。为了便于检测细胞内钙动员并促进被动扩散，将乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能团连接到钙指示剂的核心结构上。这增加了指示剂的疏水性，使其易于穿透完整的质膜，并通过小化非特异性背景荧光来增强指示剂灵敏度，因为AM酯偶联的指示剂基本上是无荧光且无活性的。

一旦探针进入活细胞，并且仅在细胞内酯酶除去AM酯官能团后，才开始活性。激活后，探针会通过螯合检测钙，并通过生成相对于钙浓度的荧光信号作出响应。指标如FLUO-8 ^®，AM（目录号21080），加州-520 ^®，AM（目录号21131）和Calbryte ^™  520，AM（目录号20653）进行了广泛的钙成像中使用，钙通量分析以及用于药物发现的基于细胞的高通量筛选（HTS）分析。钙指示剂与流式细胞仪，荧光显微镜和荧光微孔板平台兼容。除了提供荧光和发光钙指示剂外，我们还提供了几种非荧光钙信号分子和螯合剂，用于测量和操纵细胞内和细胞外钙。

单波长钙指示剂

单波长钙指示剂被广泛用于监测钙动员，对钙信号的空间动态进行成像，以及在基于HTS细胞的药理学筛选中，通过GPCR来分析激动剂刺激和拮抗剂抑制的信号。这些指示剂在饱和钙水平下显示出显着的钙依赖性荧光强度变化，而不会改变其吸收或发射波长。我们已经开发了多种钙指标，包括FLUO-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™系列，以动员跟踪钙与亮的荧光信号和各种波长和亲和力的选择，以满足多种应用。

单波长指示器的好处

• 静息钙水平下背景荧光小
• 改善的信噪比
• 大大提高了细胞保留
• 活细胞钙分析的细胞渗透形式（与成像，流式细胞仪和微孔板检测（例如HTS）兼容）
• 细胞不渗透形式，可通过微量注射，贴片移液器或松果体上样进行上样
• 紫外线（UV），紫色和可见光激发格式
• 低，中和高亲和力格式可提供满足许多应用的灵敏度范围

图1.在CHO-K1细胞中测得的ATP反应。加入含丙磺舒的HH缓冲液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte™520 AM（Cat No. 20653）或含丙磺舒的HH Buffer中的10μg/ ml Fluo-4，AM（Cat No. 20550），并孵育45分钟在37°C下。然后除去染料加载溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替换。加入ATP（50 µL /孔）以达到指示的10 µM浓度，然后用显微镜FITC通道（Keyence）成像。

表1的Fluo-3的光谱进行比较，的Fluo-4，的Fluo-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™520个绿色荧光钙指标。

1. K _d：钙解离常数。
2. Φ：在5 mM柠檬酸钙存在下的荧光量子产率。
3. F _Ca / F _Free：相对于无钙指示剂形式，钙结合指示剂的荧光强度增加。

表2. Rhod-2，Rhod-4™，Rhod-5N和Rhod-FF橙/红荧光钙指示剂的光谱比较。

1. K _d：钙解离常数。

比例钙指标

与单波长指示器相比，比率式（或双波长）指示器具有*的光谱特性，这些光谱特性是响应钙离子结合而触发的。当与钙结合时，比例指示剂的佳吸收率或发射波长强度都会发生变化。例如，双重激发钙指示剂Fura-2，AM和Fura-8™，AM在结合或不含钙时均显示两个峰值激发波长。当分别在结合钙的和无钙的峰值激发波长下激发时，钙浓度的增加会引发双激发指示剂的荧光发射强度的增加和减少。

比例指标的好处

• 比例测定可准确测量细胞内钙浓度
• 小化不均匀染料加载，染料渗漏，光漂白和变化的细胞厚度（在混合种群中常见）的影响
• 提供更可靠和可重复的结果
• 双重激励或双重排放格式的指示器
• 活细胞钙分析的细胞渗透形式（与成像，流式细胞仪和微孔板检测（例如HTS）兼容）
• 细胞不渗透形式，可通过微量注射，贴片移液器或松果体上样进行上样
  • 选择不渗透细胞的比例指示器。

图2.在用的Fura-2 AM（目录号测量CHO-K1细胞的ATP剂量响应21023）和的Fura-8™AM（目录号21056）。将CHO-K1细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在黑壁/透明底部96孔板中过夜接种，然后与Fura-2 AM或Fura-8 AM钙测定染料上样溶液孵育1小时。ATP剂量由Flexstation添加。

比例钙指示剂指南

下表列出了细胞渗透性钙比率指示剂的规格，其吸收和发射大值以及钙解离常数。还可以使用每种比例指示剂的不渗透细胞的钾盐和钠盐衍生物。

Calbryte™钙指示剂

该Calbryte™系列是为监测细胞内钙动员亮和强大的钙指标的家庭。它包括三种新颖的钙指示剂，Calbryte™520，Calbryte™590和Calbryte™630，它们的吸收和发射波长主要不同。Calbryte™探针以显着更高的信号本底特性发射荧光信号，并大大增强了细胞保留能力。Calbryte™系列已经过优化，可用于荧光显微镜，荧光酶标仪和流式细胞仪。它们还可以用于高通量筛选应用。

Calbryte™系列的优点

• 在相同条件下，Calbryte™探针比任何其他钙指示剂都明显更亮
• 大大提高了信噪比
• 增强的细胞内保留，消除了丙磺舒的使用
• 45至60分钟内即可快速方便地装载细胞
• 均质胞质定位
• 红移的Calbryte™590和Calbryte™630可与GFP或其他绿色荧光染料一起使用以进行多路复用

图3.在使用CHO-K1细胞中内源性P2Y受体ATP的荧光信号响应的比较屏幕任务™Calbryte™520钙测定试剂盒，FLIPR ^®钙4分析（Molecular Devices）中，和的Fluo-4的直接™钙离子测定（分子探针^®）。将CHO-K1细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔在96孔黑壁/透明底部肋骨板上接种过夜。钙通量响应分别用所有三种测定法测量。FlexStation 3添加了ATP（50 µL /孔）以达到指示的浓度。

Calbryte™系列钙指示剂指南

下表列出了Calbryte™钙指示剂的规格，其吸光度和发射大值以及钙解离常数。还可以使用Calbryte™钙指示剂的其他包装规格

1. 渗透性： AM酯钙指示剂具有细胞渗透性，可以被动加载到活细胞中（加载到细胞培养基中）。K ⁺盐，Na ⁺盐和NH ₄ ⁺盐钙指示剂是不渗透细胞的，可通过微量注射，贴片移液管或松果体细胞加载。

CAL-520 ^®钙指标

在CAL-520 ^®系列是荧光钙敏感染料的全面的产品组合。它包括六个指标，加州-500™，加州-520 ^®，加州-590™，加州-630™，加州-670™和CAL-770™，它主要是在它们的吸收和发射波长不同。每种校准染料在钙的静置水平下发出的荧光极少，在饱和钙浓度下其荧光强度增加> 100倍。Cal染料可以以细胞可渗透的AM酯形式以及不渗透细胞的钾盐，钠盐和葡聚糖结合物形式提供。

在CAL-520的优点^®系列

• 比Fluo-3，Fluo-4，Rhod-2和Rhod-5更高的信噪比
• 增强的细胞内保留
• 方便高效的细胞加载
• 均质胞质定位
• 红移的Cal-590™，Cal-630™，Cal-670™和Cal-770™可与GFP或其他绿色荧光染料一起使用，以进行多路复用
• Cal-770™可用于体内研究
• CAL-520 ^®，CAL-590™，CAL-630™，在可供™CAL-670™和CAL-770 3000兆瓦和10000种兆瓦葡聚糖缀合物格式

图4.用Cal-520™AM（目录号）或Fluo-4 AM（目录号）孵育的CHO-K1细胞中ATP刺激的内源P2Y受体钙反应。将CHO-K1细胞以每100 µL每孔50,000个细胞的接种量在Costar黑墙/透明底部96孔板中过夜。将HHBS中的100 µL 5 µM Fluo-4 AM或Cal 520™AM（不含丙磺舒）加到样品中，并在37°C下孵育1小时。使用FlexSation添加ATP（50 µL /孔）以达到指示的浓度。

CAL-520 ^®系列钙指示剂导向

下表列出了规格为校准-520 ^®钙指示剂系列，它们的吸收率和发射大值，和它们的钙离解常数。在CAL-520的其他包装规格^®钙指示剂系列可供选择，

1. 渗透性： AM酯钙指示剂具有细胞渗透性，可以被动加载到活细胞中（加载到细胞培养基中）。K ⁺盐，Na ⁺盐和NH ₄ ⁺盐钙指示剂是不渗透细胞的，可通过微量注射，贴片移液管或松果体细胞加载。

FLUO 8 ^®钙指标

FLUO-8 ^® AM地址的主要限制常见的基于FLUO染料，即要求小区负载的苛刻条件之一。需要加载传统的基于Fluo的染料，例如Fluo- 2 AM（Cat No. 20495），Fluo-3 AM（Cat No. 21013）和Fluo-4 AM（Cat No. 20550），并在37°C与细胞孵育长达一个读数可以采取前一小时，这不仅科目细胞苛刻的温度下，也需要用户花费时间的加热和冷却细胞培养物。此外，它引入了温育温度为可能的混杂变量。FLUO-8 ^® AM通过提供可以在室温下被加载到细胞中的鲁棒钙指示剂解决所有这些问题。FLUO-8 ^®AM与其他基于氟的染料相比，对温度的依赖性较小，因此可以在更宽的实验条件下获得更一致的结果。此外，具有少至20分钟的温育时间，的Fluo-8 ^® AM能够改善生产率快速周转。好的部分是，即使结构上的修改和改进，FLUO-8 ^® AM的光谱特性保持不变，保持的Fluo-4 AM的熟悉光谱（即实施例/ EM = 494 / 517nm）。

在8的Fluo的好处^®系列

• 更快的细胞加载：8的Fluo ^®可以很容易地装载到在室温下的细胞。Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37°C的加载温度
• 亮的荧光：8的Fluo ^®是2倍亮度比的Fluo-4 AM，和比的Fluo-3AM明亮4倍
• 方便：8的Fluo ^®的相同光谱的那些的Fluo-4和的Fluo-3使升级容易的

学到更多：

• Fluo-3和Fluo-4钙指标

图5.在HEK-293细胞中测出的卡巴胆碱剂量反应。将Hek-293细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑墙/透明底部96孔板中过夜接种。将细胞使用的Fluo-8用100μL的染料加载溶液中温育^® AM（目录号21083）或荧光4 AM（目录号20550）在室温下1小时。用NOVOstar（BMG Labtech）加入Carbachol（50μL/孔）达到指示的浓度。

FLUO 8 ^®钙指示剂导向

下面列出规格表中为8的Fluo ^®钙指示剂系列，它们的吸收率和发射大值，和它们的钙离解常数。在8的Fluo附加的包装规格^®钙指示剂系列avaible，

1. 渗透性： AM酯钙指示剂具有细胞渗透性，可以被动加载到活细胞中（加载到细胞培养基中）。K ⁺盐，Na ⁺盐和NH ₄ ⁺盐钙指示剂是不渗透细胞的，可通过微量注射，贴片移液管或松果体细胞加载。

Fluo-3

Fluo-3是钙指示剂，于1989年*推出，用于流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜。荧光素样化合物Fluo-3在没有游离Ca ²⁺的情况下实际上是无荧光的。但是，与钙结合后，Fluo-3在525 nm处的发射强度会急剧增加。作为指示剂，Fluo-3在细胞信号通路，肌细胞和神经递质激活研究中至关重要。

Fluo-4

Fluo-4建立在Fluo-3的核心结构上，但对其进行了修改以提高荧光信号强度。化学结构的改变导致Fluo-4的大激发蓝移，从506nm（Fluo-3）到494nm。实际上，这12 nm的偏移将Fluo-4的大激发光移至接近标准氩激光的波长（即488 nm）。这会导致更好的激发，从而产生荧光信号，该信号明显更亮并且对钙浓度的变化更敏感。

图6.将 U2OS细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在96孔黑色壁/透明底部肋骨板上接种过夜。生长培养基除去，将细胞用100μL的Fluo-3 AM的，的Fluo-4 AM和的Fluo-8孵育^®在4μM的在37℃，5％CO的浓度AM在HHBS ₂培养箱中1小时。细胞用200 µL HHBS洗涤两次，然后使用FITC通道在荧光显微镜（Olympus IX71）上成像。

Fluo 3和Fluo 4钙指示剂指南

下表列出了Fluo 3，Fluo 4和Fluo 5钙指示剂的规格，其吸收和发射大值以及其钙解离常数。

1. 渗透性： AM酯钙指示剂具有细胞渗透性，可以被动加载到活细胞中（加载到细胞培养基中）。K ⁺盐，Na ⁺盐和NH ₄ ⁺盐钙指示剂是不渗透细胞的，可通过微量注射，贴片移液管或松果体细胞加载。

产品订购信息

非荧光钙螯合剂，信号分子和测定试剂

传统单波长钙指标

比例钙指标

Calbryte™钙指示剂

CAL-520 ^®钙指示剂系列

Fluo- ^8®，Fluo-5，Fluo-4和Fluo-3钙指示剂系列