chondrex胶原酶简介

Cat# 5002 - 重组人 MMP-13（截断型） - 处于缺货状态，直至未来通知。给您带来的不便，我们深表歉意。

胶原酶是基质金属蛋白酶 (MMP) 家族的成员，这是一组参与细胞外基质 (ECM) 和结缔组织的生理和病理更新的蛋白酶。MMP 可以根据其报告的底物特异性（胶原酶、明胶酶、溶基质素）和结构（膜型 MMP）进行分组。胶原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13）可以特异性降解天然纤维状胶原蛋白（I、II、III、VII 和 X 型）在其定型三螺旋结构域中，以及变性胶原蛋白（明胶）。然而，底物特异性因胶原酶而异。胶原酶在健康组织中的表达通常较低，但在炎症条件、恶性组织和其他产生促炎细胞因子环境的病理条件下会升高。因此，胶原酶是影响软骨组织的疾病的有趣治疗靶点。

为了研究蛋白酶对天然 I 型胶原蛋白和 II 型胶原蛋白底物的活性，Chondrex, Inc. 提供了快速胶原酶活性测定试剂盒以及 细菌胶原酶活性测定试剂盒。通过使用天然形式的胶原蛋白作为底物，这些测定可以排除其他 MMP 的酶活性，因为只有胶原酶可以切割天然形式的纤维状胶原蛋白。此外，MMP-13 Inhibitor Activity Assay Kit适用于评估 MMP-13 抑制剂的功效。 

Chondrex, Inc. 还提供全长潜伏型重组人 MMP-8（货号 5001）以及截短的重组人 MMP-13（货号 5002），它们是使用 I 型胶原蛋白进行胶原酶活性测定的理想参考(Cat# 4001) 和 II 型胶原蛋白 (Cat# 4002) 底物。

胶原酶检测试剂盒

胶原酶底物

胶原酶 (MMP)

快速胶原酶活性测定试剂盒

胶原酶活性快速检测试剂盒利用重组人中性粒细胞前胶原酶 (MMP-8) 作为参考胶原酶，以及两种类型的胶原酶激活剂（APMA 和胰蛋白酶）。Cat#3001 使用 FITC 标记的牛 I 型胶原蛋白，而 Cat#3002 使用 FITC 标记的 II 型胶原蛋白作为胶原酶底物。使用这些荧光底物可以实现比传统底物凝胶分析快 10 倍的反应和更短的工作时间（约 2 小时）。每个归类为胶原酶的 MMP 都可以切割天然形式的纤维状胶原蛋白。然而，它们对胶原蛋白类型的亲和力不同：MMP-1 更容易降解 III 型胶原蛋白，MMP-8 更容易降解 I 型胶原蛋白，而 MMP-13 优先降解 II 型胶原蛋白。鉴于这些差异，在选择 MMP 活性检测方法时，重要的是要考虑 MMP 的底物特异性。

下面的图 1提供了有关这些试剂盒中使用的检测系统的更多信息。胶原酶会在 N 端切割胶原蛋白。 

这些 FITC 胶原底物以及参考 MMP 酶可单独购买。

图1。快速胶原酶活性测定试剂盒程序的一般概述。有关更多信息，请参阅试剂盒协议。 

激活参考 MMP* 和样品 MMP 是该检测中最关键的步骤之一。APMA 是潜伏胶原酶的通用激活剂。然而，样品中可能含有胶原酶抑制剂（例如 α 2 巨球蛋白、TIMPs），可以阻止 APMA 的反向激活。因此，对于这些样品，胰蛋白酶也被用作活化剂。有关胶原酶活性测定样品制备的更多信息，请联系我们。 

细菌胶原酶活性检测试剂盒

我们对细菌胶原酶的了解大部分来自使用从溶血梭菌中发现的（细菌或哺乳动物来源的）第一种胶原酶的实验. 基于这些研究，细菌胶原酶根据其反应性分为两类。I类胶原酶对胶原蛋白活性强，对合成分子活性弱。II 类胶原酶与合成肽反应强烈，但与胶原蛋白反应较弱。然而，自从进行这些分类以来，已经鉴定了几种其他类型的细菌胶原酶。在病理学上，细菌胶原酶是许多病原菌的重要毒力因子，主要负责降解宿主 ECM 并为细菌生长和增殖提供生态位 (1)。有趣的是，溶组织梭菌胶原酶已用于治疗 Dupuytren 病和佩罗尼病 (2,3) 患者。

细菌胶原酶活性测定试剂盒利用溶组织梭菌胶原酶作为参照，并使用 FITC 标记的可溶性牛 I 型胶原底物。与基质凝胶分析和基于放射性标记的胶原蛋白的分析相比，该分析系统提供了更快的反应时间和更高的灵敏度。使用该试剂盒可以运行大约 100 个胶原酶活性测定和/或胶原酶抑制剂测定样品。
该试剂盒类似于用于哺乳动物 MMP（胶原酶）的快速胶原酶活性检测试剂盒，但有几个主要区别。与哺乳动物 MMP 不同，细菌胶原酶会将胶原蛋白*降解为变性的肽片段。因此，弹性蛋白酶消化对于该测定是必要的。此外，细菌检测通常已经以其活性形式存在，因此不需要激活步骤。 
细菌胶原酶活性检测试剂盒是检测 I 类胶原酶活性以及评估 I 类胶原酶抑制剂的理想选择。有关不同协议的更多信息，请参阅试剂盒协议。 

酶活性的计算

胶原酶活性试剂盒包括参考胶原酶，但是样品中的酶活性不能像在 ELISA 中那样使用标准曲线计算。相反，胶原酶活性必须计算为单位/分钟/毫升，以便在标准和样品之间进行适当的比较（图 2）。

图2。MMP-8 活性曲线示例。A) 使用 FITC I 型胶原蛋白作为底物的 MMP-8 活性剂量反应 - 不同量（2.5 – 10 µl）的参考 MMP-8（100 单位/毫升）在 35 ℃与 100 µg FITC I 型胶原蛋白反应°C 60 分钟。加入 10 µl Enhancer 后，将混合物在 35°C 下进一步孵育 10 分钟。B)使用 FITC-I 型胶原蛋白作为基质的 MMP-8 活性时间 - 2.5 ml MMP-8（100 单位/ml）与 100 µg FITC-I 型胶原蛋白在 35°C 下反应 90 分钟。

1 单位的胶原蛋白溶解活性定义为每分钟裂解 1 µg 胶原蛋白（1 胶原蛋白溶解单位 = 1 µg/分钟）。由于该试剂盒使用 100 µg 胶原蛋白作为底物，因此可以使用以下公式计算溶胶原活性：

图3。在 Chondrex, Inc. 的胶原酶活性测定试剂盒中计算溶胶原活性的方程式。FI sample :样品的荧光强度；FI空白: 空白 FI控制的荧光强度 : 控制的荧光强度

该试剂盒的检测灵敏度受反应（孵育）时间的影响很大。更长的孵育时间会增加检测的灵敏度。然而，由于其他蛋白酶降解或变性胶原蛋白片段，过度孵育会增加背景信号。此外，反应时间不足（10 分钟或更短）可能会影响检测的重现性。推荐的孵育时间为一小时；但是，必须针对您的样品优化反应时间。测定灵敏度可以通过比较样品的荧光强度 (FI) 和空白的 FI 来确定。为了获得准确的测定结果，样品的 FI 应至少比空白的 FI 高 1.5 倍。例如，如果空白 FI 为 1000，则样品 FI 必须高于 1500 才能获得准确的测定结果。  

测定温度也会影响测定灵敏度。一旦胶原蛋白热变性（天然胶原蛋白为 40°C，胶原酶裂解的胶原蛋白为 35°C），由于弹性蛋白酶消化变性胶原蛋白，样品结果可能被高估。此外，在选择底物时，胶原底物的酶特异性是一个重要的考虑因素。 

FITC 标记的 I 型和 II 型胶原蛋白

FITC 标记的牛 I 型和II 型胶原蛋白（以 1:1 的比例结合）是检查胶原酶活性的底物。为了最大限度地减少 MMP（胶原酶）测定中的背景值，这些标记的底物已制备为不含端肽。此外，非特异性结合胶原蛋白的 FITC 已通过离子交换色谱法去除。

FITC 标记的胶原蛋白也可用于为原代细胞培养创建支架或建立细胞培养。如果以这种方式使用，则可以通过测量培养物上清液中降解的 FITC 胶原蛋白的 FI（520 nm 发射/490 nm 激发）来确定细胞的胶原酶活性。然而，培养基中存在的蛋白质和染料可能会导致 FI 猝灭。优化检测和培养条件有助于确保一致和可靠的结果。

出于这个原因，Chondrex, Inc. 建议在创建细胞培养支架时使用高浓度的 FITC 胶原蛋白。请与我们联系以获取更多信息。  

Chondrex, Inc. 还提供许多其他等级的纯化胶原蛋白，用于各种实验目的。 

MMP-13 抑制剂检测试剂盒

MMP-13（胶原酶 3）是一种最初在乳腺癌中发现的基质金属蛋白酶 (4)。随后，MMP mRNA 分析显示骨关节炎 (OA) 软骨细胞 (5-7) 以及多种恶性肿瘤类型 (8) 中 MMP-13 的表达水平增加。在生理上，MMP-13 主要在胚胎发育 (9,10) 和伤口愈合 (11,12) 期间发挥作用。已观察到软骨细胞和滑膜细胞中 MMP-13 的产生被炎症介质如白细胞介素 17 (IL-17)、IL-1、肿瘤坏死因子 α (TNF-α)和制瘤素 M (13- 15)。天然存在的金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMP) 在 MMP 活性的调节中也起着关键作用 (16)。

鉴于 MMP-13 倾向于降解 II 型胶原蛋白，它与类风湿性关节炎 (RA) 和 OA 中的软骨破坏有关。因此，几种 MMP-13 抑制剂已在小鼠胶原诱导的关节炎模型中作为治疗化合物进行了测试 (17)。事实上，已经开发并广泛研究了几种人为的 MMP 抑制剂（主要是锌螯合剂，如 batimastat 和 marimastat，它们可阻断 MMP 的催化位点）作为多种疾病的治疗剂。然而，由于严重和全身性的副作用，它们在临床试验中都失败了 (18)。最近，新类别的更具选择性的 MMP 抑制剂（例如基于单克隆抗体的抑制剂和工程蛋白）作为癌症和 OA 的治疗选择引起了人们的兴趣。 

Chondrex, Inc. 的MMP-13 Inhibitor Assay Kit 提供了一种简单的方法来筛选和评估实验性 MMP-13 和其他 MMP 抑制剂的功效。使用截短的重组人 MMP-13 (rhMMP13) 和蛋白酶抑制剂作为参考，您可以监测合成荧光肽底物*的裂解。只需使用任何感兴趣的实验抑制剂化合物代替试剂盒提供的蛋白酶抑制剂（目录号 30046）来评估化合物的抑制潜力。 

*底物不含胶原三螺旋，因此对非胶原蛋白水解蛋白酶敏感。

图 4 - 产生胶原酶的树突细胞：  由含有 IL-1 的中性粒细胞提取物刺激的大鼠滑膜细胞触发成纤维细胞向树突细胞的形态变化。

重组人 MMP-8（胶原酶 2）

MMP-8（也称为中性粒细胞弹性蛋白酶）是一种由活化的中性粒细胞释放的胶原酶，可优先降解 I 型胶原蛋白。MMP-8 蛋白水解活性被 TIMP-1 和 TIMP-2 抑制。与许多其他 MMP 不同，MMP-8 的功能似乎可以抑制肿瘤转移 (19,20) 以及实验性关节炎模型 (21)。在分析生理和病理条件下的 MMP 动态时，Chondrex, Inc. 的重组人 MMP-8是一种有用的参考胶原酶。 

在测定胶原酶活性或评估 MMP/胶原酶抑制剂（如 TIMPS）时，最关键的步骤之一是激活潜在的胶原酶。Chondrex, Inc. 的重组人 MMP-8 是一种全长、潜伏的胶原酶，可用于此目的。此外，Cat# 3001 可以使用 APMA 激活，因此也可用于评估 MMP（胶原酶）抑制剂。 

重组人 MMP-13（胶原酶 3），截短

MMP-13 具有多种生理作用（骨代谢、伤口愈合）以及多种病理状况（肿瘤侵袭和转移 (22)、骨关节炎 (23)）。重组人胶原酶原 MMP-13的活性形式（从 C 端截断）可用于通过使用荧光合成肽作为底物来研究抑制剂。然而，重要的是要注意这种截短形式的 MMP-13 不能消化天然胶原蛋白，因为它不包含胶原蛋白结合基序。

胰蛋白酶活性测定试剂盒

胰蛋白酶由胰腺产生，在促进小肠中的蛋白质消化和营养吸收方面起着关键作用。它还通过控制肠腔中的杀微生物剂浓度和维持上皮屏障的完整性来帮助调节胃肠道免疫反应 (24,25)。由于这些功能，胰蛋白酶被广泛用于蛋白质或肽相关研究，以合成和测序肽、维持培养的细胞和消化蛋白质 (26)。 

Chondrex, Inc. 提供了一种显色胰蛋白酶活性测定试剂盒，它使用 Boc-Gln-Ala-Arg-pNA 底物在短短 15 分钟内测量胰蛋白酶样酶活性。胰蛋白酶裂解底物 Arg 中的羰基，释放出对硝基苯胺 (pNA)，产生黄色并可使用光密度进行量化 (27)。该试剂盒适用于胰蛋白酶和任何裂解底物的蛋白酶/肽酶。