支原体污染一直是细胞生物学研究面临的主要问题之一，因为它们会影响或改变细胞的生理机能。由于其寄生特性和适应宿主细胞的能力，支原体经常作为污染物出现在细胞培养物中。 [1]
支原体没有细胞壁。出于这个原因，它们对靶向细菌细胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，这些抗生素通常用于细胞培养。细胞壁的缺乏以及它们的小尺寸（通常为 0.2 - 0.3 ?m）也使它们在传统显微镜下的检测变得复杂。它们的小尺寸和非常灵活的形式也意味着支原体不能通过无菌过滤从液体介质中去除。
由于缺乏宏观效应，支原体可能长期未被发现。特别是在使用标准抗生素的日常工作中，实验室工作人员的支原体污染可能会在很长一段时间内未被发现，因为其他细菌的污染通过添加抗生素而被选择性抑制，而同时引入的支原体可以不受阻碍地繁殖。
鉴于此，许多研究表明细胞培养物的支原体污染水平高达 40% 也就不足为奇了。这些高污染水平的一个可能原因被认为是由实验室工作人员、血清或胰蛋白酶、外来细胞培养物（交叉污染）或最终由收获细胞培养物的动物引入的。 [3]
文献：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯图加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
由于污染的存在会影响从细胞培养中获得的结果的准确性，或者在最坏的情况下，会损害细胞生长到整个培养物丢失的程度，因此必须定期检查细胞培养物中是否存在支原体污染。特别是在细胞转染中必须排除支原体污染，因为污染对细胞生长和代谢的负面影响会导致转染效率急剧下降。
支原体是软体菌类中的几个细菌属之一。软体动物是人类、动物和植物的微小寄生虫或共生体；根据定义，支原体属的 100 多种*物种仅限于脊椎动物宿主，在那里它们被称为许多疾病的病原体（例如由肺炎支原体引起的肺炎）。
细胞表面支原体菌落的电子显微镜图像 [2]
支原体细胞非常小，没有细胞壁。因此，它们不受靶向细胞壁合成的抗生素的影响。支原体的基因组大小范围为 0.58 – 1.38 兆碱基对，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自动复制能力的原核生物中最小的。
作为需氧或兼性厌氧生物，支原体与其宿主理想地对齐，因此因此在细胞培养物 (37°C) 中找到最佳生长条件。
...损害细胞生长
...降低宿主细胞的代谢活性
...调节细胞的细胞因子产生
...在体外诱导染色体畸变
...通过标准无菌过滤器
...对抗生素如青霉素或链霉素具有抗性通常用于细胞培养
...耐高温和脱水
...影响转染效率
支原体可以在几乎所有已知的细胞类型中增殖，因此无处不在。据估计，大约 80% 的日本细胞培养物、65% 的阿根廷细胞培养物和 15% 的美国细胞培养物被支原体污染。该图显示了支原体污染对 HeLa 细胞生长的广泛影响。
由于支原体污染具有不可见且不会导致细胞死亡的特殊特性，因此污染可能会在很长一段时间内未被发现。然而，这些细菌对转染成功有广泛的影响：
• 由于精氨酸需求增加，细胞生长显着减少
• 支原体调节细胞因子的产生
• 支原体导致染色体畸变
• 支原体滞留在细胞膜中，并可能调节细胞膜过程，例如内吞作用。
所有这些操纵的生理过程也参与转染过程。该图显示了支原体污染对 HeLa 和 HepG2 细胞的广泛影响：与未污染细胞相比，效率分别提高了 17% 和 5.6%。
在 48 孔板上用 pCMVßgal 转染 HeLa 和 HepG2 细胞。通过 ONPG 和 BCA 分析评估比吸收值。左边的条形显示由支原体污染导致的转染效率大大降低。
DAPI染色
在细胞培养物中检测支原体的一个流行应用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色细胞。DAPI 强烈嵌入 DNA 的小沟中，并在紫外线激发下在最大 460 nm 处显示出相对较宽的荧光发射。在无支原体细胞培养中，仅标记细胞核。如果存在支原体细胞，它们的 DNA 也会被标记。由于它们的体积小，单个支原体细胞无法在荧光显微镜下分辨：只有高度污染会导致可见的模糊面纱形成，这可能无法清楚地识别。
聚合酶链反应
更灵敏的支原体检测方法是 PCR。可以在非常早期的污染和低浓度状态下检测细胞培养物中的支原体。这种检测方法通常适用于细胞培养工作。
其他
虽然 ELISA 测试经常用于支原体的常规检测，但这种方法在灵敏度和特异性方面并不优于 DAPI 测试。另一种方法是电子显微镜，然而，它需要先进的设备并且更耗时。
结论
为确保细胞培养物中支原体污染引起的诸多问题最终成为过去，Biontex 提供了一系列基于 PCR 的检测支原体检测试剂盒：
MycoSPY®（常规 PCR 检测试剂盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 检测试剂盒，包括 Master Mix 和用于凝胶电泳的上样缓冲液和示踪染料
该产品对已建立的细胞系和原代细胞均取得了优异的结果。
 | |
用 DAPI 染色的 Cos7 细胞，无 | DAPI 染色未能揭示 |
 | |
当存在* 水平的支原体污染时，这些 DAPI 染色的 H441-Luc 细胞仅在细胞外围 | 所有这三种 |
| 方法 | DAPI-测试 | 酶联免疫吸附试验 | MycoSPY® | 电子显微镜 |
|---|---|---|---|---|
| 努力 | + | + | + | -- |
| 费用 | ++ | 0 | + | -- |
| 灵敏度 | -- | - | ++ | + |
| 全部的 | + | 0 | ++++ | --－ |
对于被细菌污染的细胞培养物的处理，通常使用标准抗生素。但是作用于细胞壁的抗生素（如青霉素）对支原体无效。
因此，我们提供产品MycoRAZOR®，这是一种抗生素混合物，可损害蛋白质生物合成（转录和翻译）。
是的。重要的是检查支原体是否已被MycoRAZOR®（例如，通过使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）*消除，以防止产生耐药性。由于耐药性的产生方式与所有抗生素的使用方式相同，因此*消除支原体至关重要。
首先检查是否在上次使用MycoRAZOR®和当前测试之间进行了两次未使用MycoRAZOR®的传代。如果不是这种情况，则可能已检测到死支原体，特别是通过高度敏感的方法，例如 PCR。如果观察到最后一次应用和测试之间的最短时间，请在接下来的五次细胞传代中使用MycoRAZOR®，逐渐增加MycoRAZOR®的剂量，最大稀释度为 1/25。请注意，根据细胞类型，增加MycoRAZOR®的浓度可能会产生毒性作用. 如果您在细胞中观察到毒性作用（增殖率降低；细胞形态变化），请在剩余周期中使用最后一次使用的剂量。必须使用支原体检测试剂盒（例如MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）测试每种治疗的结果！
细胞培养中使用的动物产品是支原体污染的主要来源。为避免这种风险，请仅使用保证不含支原体的胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶。
支原体属于 Mollicutes 类，因此缺乏细胞壁，它们对许多攻击细胞壁合成的抗生素具有抗性。因此，在将此类抗生素（例如青霉素/链霉素）用于细胞培养的常规使用中，使用者本身是重要的污染源。在这种情况下，非无菌工作条件会被忽视，因为添加抗生素会阻止大多数细菌的生长——从而阻止宏观效应——同时允许支原体不受阻碍地繁殖。
此外，来自另一种细胞培养物的交叉污染是可能的。出于这个原因，始终测试所有培养的细胞并更换任何可能被污染的细胞培养材料（培养基、FBS、胰蛋白酶、缓冲液）。
第MycoRAZOR®不包含任何doxy-或四环素类抗生素。
大多数基于 PCR 的支原体检测试剂盒都包含一个质粒作为阳性对照，该质粒编码支原体的 16S rRNA。这确保了引物的功能。如果存在支原体污染，该质粒产生的 DNA 扩增子的大小与预期的相同或相似。因此，带有阳性对照的 PCR 必须在单独的管中进行。通常还包括内部对照，以确保 PCR 不受来自细胞培养上清液的蛋白质和细胞碎片的抑制。内部对照产生与支原体污染的细胞样本不同长度的 DNA 扩增子。因此，内部控制可以在每种方法中进行。
MycoSPY® Master Mix试剂盒和MycoSPY®试剂盒中包含的内部对照是一种质粒，它编码支原体 16S rRNA 的缩短形式。因此，内部对照用作阳性对照，并确保对于每种 PCR 方法，细胞培养上清液中不存在抑制剂。因此，它排除了假阴性结果。
两者MycoSPY®主混合物的试剂盒和MycoSPY®试剂盒检测至少80份支原体基因组的。内部控制稍微降低了灵敏度。由于支原体在细胞培养物受到污染后繁殖相对较快，因此这种敏感性就足够了。
因此，我们建议在每次 PCR 中添加内部对照，以确保不存在来自细胞培养上清液的任何现有抑制剂（蛋白质、细胞碎片）。
没有必要避免使用常规抗生素，例如青霉素、链霉素或庆大霉素，因为它们不会抑制MycoSPY® Master Mix Kit 或MycoSPY®试剂盒的检测。
是的。我们建议在 20°C 下储存，不含添加剂（例如 DMSO）。解冻后，应按照手册中的说明制备细胞培养上清液。
我们建议将细胞培养至少 48-72 小时，或直到生长区域的覆盖率至少达到 80%。对于悬浮细胞，细胞密度应大约在推荐用于传代培养的细胞数范围内。由于在细胞培养上清液中检测到支原体，因此在此期间不应更换培养基。
我们建议至少每 1-2 个月进行一次支原体 PCR（例如使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix），尤其是在存在抗生素（例如 pen/strep）的情况下培养细胞时。这些抗生素可防止发现未消毒的工作技术，但会导致细胞培养物受到支原体污染。
