aatbio Covidyte™ TF670说明书

Covidyte™ TF670

概述

冠状病毒 (CoV) 可以感染人类和多种动物，引起广泛的疾病。2019 年底，一种被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的冠状病毒被确定为导致几例呼吸系统疾病 (Covid19) 的原因。该病毒在全球范围内迅速传播。它已经感染了超过 100 万人，Covid19 已造成 7 万多人死亡（截至 2020 年 4 月 6 日）。目前，没有任何具体有效的治疗 Covid19 的选择。目前，Covid19的临床治疗主要是对症联合对已上市的抗病药物如瑞德西韦和抗生素进行再利用来治疗继发感染。Covidyte™ TF670 是一种包含 14 个氨基酸序列 (KTSAVLQSGFRKME) 的肽底物，可被冠状病毒蛋白酶切割。dark-FRET 肽在 N 端和 C 端分别含有 Tide Quencher™ 5 (TQ5) 作为猝灭剂和 Tide Fluor™ 5 (TF5) 作为荧光供体，其中 TF5 的荧光在肽段被 TQ5 有效猝灭时完好无损。当肽被冠状病毒蛋白酶水解时，TF5 片段会产生显着增强的荧光，因为它的荧光不再被 TQ5 淬灭。TF5的荧光强度可以有效监测冠状病毒蛋白酶的活性。Covidyte™ TF670 是一种强大的高通量筛选工具，用于搜索冠状病毒蛋白酶的抑制剂。TQ5-TF5 对已被证明是用于开发 FRET 蛋白酶底物的极为有效的 FRET 对。与常用的 EDANS 底物（如 Covidyte™ EN450）相比，TF670 底物具有更强和更长的荧光，较少受有色化合物的干扰，而这些有色化合物通常会导致假阳性命中。

示例协议

准备解决方案

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性使用的等分试样，并在制备后储存在 -20°C。避免重复冻融循环。

Covidyte™ TF670 原液 (200X)

将 25 µL（对于 cat# 13540）或 250 µL（对于 cat# 13541）DMSO 添加到 Covidyte™ TF670 小瓶中。
注意     制作一次性等分试样并储存在 -20 °C。

准备工作解决方案

1. Covidyte™ TF670 工作液

在 20 mM Tris 缓冲液 (pH 7.5) 或您选择的缓冲液中以 1:200 稀释底物储备溶液。在 96 孔板中每次测定使用 50 μL 的底物溶液。

2. 冠状病毒蛋白酶稀释

根据需要稀释冠状病毒蛋白酶。

示例实验协议

一个 96 孔板的样品协议

1. 将 50 μL 的每种蛋白酶稀释液添加到检测板的各个孔中。
   

2. 在每个蛋白酶稀释液中加入 50 μL Covidyte™ TF670 工作溶液。
   

3. 在 Ex/Em = 640/680 nm（截止 660 nm）处使用荧光读板器监测荧光增加。 

对于动力学读数：立即开始连续测量荧光强度，每 5 分钟记录一次数据，持续 30-120 分钟。
对于终点读数：在所需温度下孵育反应 30 至 120 分钟，避光。然后测量荧光强度。

示例数据分析和数据

图 1.蛋白酶在蛋白质激活、细胞调节和信号传导以及生成用于蛋白质合成或在其他代谢途径中利用的氨基酸中发挥重要作用。FRET 蛋白酶底物广泛用于检测蛋白酶活性，特别是对于通常需要长肽序列以实现最佳结合的病毒蛋白酶，例如冠状病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。内部猝灭的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以产生高荧光肽片段。荧光增加与蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料与我们明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被证明是开发 FRET 蛋白酶底物以用于高通量筛选应用的极其有效的淬灭剂。

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图 1.蛋白酶在蛋白质激活、细胞调节和信号传导以及生成用于蛋白质合成或在其他代谢途径中利用的氨基酸中发挥重要作用。FRET 蛋白酶底物广泛用于检测蛋白酶活性，特别是对于通常需要长肽序列以实现最佳结合的病毒蛋白酶，例如冠状病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。内部猝灭的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以产生高荧光肽片段。荧光增加与蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料与我们明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被证明是开发 FRET 蛋白酶底物以用于高通量筛选应用的极其有效的淬灭剂。

图 2. Covidyte™ TF670 的化学结构。