材料加工实验方案：


1. 培养孔包被程序： 使用这些建议作为指导来确定适合您的培养系统的最佳包被条件。

  1. 从瓶子中取出所需数量的丝溶液并分配到稀释容器中。

  2. 用水稀释丝溶液至 1 mg/mL (1:50)。

  3. 轻轻旋转内容物，直到材料*混合。

  4. 在培养表面加入适量的稀释丝溶液，确保整个表面都被涂层。

  5. 在无盖的室温下在干净的工作台 (ISO 100) 中孵育 2-3 小时以*干燥。

  6. 孵化后应用 70% 甲醇 20 分钟以诱导不溶于水的丝绸表面。

  7. 用无菌培养基或 PBS 仔细冲洗涂层表面。不要刮伤表面。

  8. 涂层表面可供使用或可在 4°C 下储存以备将来使用。

2. 浓缩丝溶液： 如果需要更高的丝浓度，则使用此技术。更高的丝浓度对于特定的加工技术或修改最终材料特性可能很重要。

  1. 准备 10% (W/V)。聚乙二醇 (PEG, 10K MW) 与去离子水的溶液。与磁性搅拌板上的大搅拌棒混合，直到 PEG *溶解。

  2. 获得分子量截止在 3,500 和 10,000 Da 之间的透析膜。如有必要，按照制造商的要求对透析盒进行水合。

  3. 根据透析膜制造商的填充量指南，用适量的 5% 丝溶液填充透析膜。

  4. 将填充丝溶液的透析膜放入 10%（重量/体积）PEG 溶液中并盖上。

  5. 指明盒式磁带添加到溶液中的时间和日期。典型的浓缩时间将根据所需的丝溶液最终浓度、被浓缩的丝溶液的体积和使用的透析膜而变化。
    注意 作为典型示例，10 mL 的 5% 蚕丝溶液在 10% (W/V) PEG 透析 20-22 小时后将产生 2-4 mL 浓缩蚕丝溶液。通常，通常根据用户要求推荐优化运行。

  6. 浓缩时间结束后，从 PEG 浴和透析盒中取出浓缩的丝溶液，并将丝溶液储存在 4°C 以备将来使用。注意：丝绸溶液的保质期随着浓度的增加而缩短，因此在生产后 1 周内尽快使用浓缩的丝绸溶液。

  7. 蚕丝溶液浓度可以通过重量百分比浓度来确定。为此，请在精密天平上称出大约 100 μL 的浓缩丝溶液并记录湿重。让溶液干燥成薄膜并测量丝蛋白干重。将干重除以湿重并乘以 100% 得到溶液的重量百分比浓度。

3. 独立式丝膜： 这种加工方法生产的独立式丝膜材料可用于细胞培养或体内移植。独立式丝膜具有易于从培养条件中移除以进行进一步样品分析的优势。

  1. 将 7 mL 的 5% 丝溶液添加到 100 mm 培养皿中，并允许在干净的工作台环境中裸露干燥。这通常需要几个小时，最好过夜。

  2. 形成的薄膜厚度约为 40-60 µm，可以使用镊子从培养皿中取出。增加蚕丝溶液的量或使用更高浓度的蚕丝溶液会产生更厚的薄膜。

  3. 这些薄膜目前是水溶性的，可以使用以下任一方法使其不溶于细胞培养：

一世。甲醇浴培养：
a．用 70% 甲醇和 30% 去离子水填充盘子并混合。
湾。将丝膜放入甲醇溶液中 10 分钟。
C。去除丝膜并用无菌水或适当的介质冲洗。
    注意： 这种处理方法可以快速产生不溶性丝膜材料特性，这些特性往往是不透明的、更疏水的，并且原位降解速度慢。

ii. 水退火：
a．获得一个清空的实验室真空干燥器，并在底部部分填充水。
湾。将薄膜放在水面上方的架子上，盖上盖子，然后拉 25 in Hg 真空。
C。停止公鸡室，并允许坐 4 小时。
d。从腔室中取出样品并用 70% 乙醇消毒，然后用无菌水或适当的介质冲洗。
   注意：这种加工方法产生的不溶性丝膜材料特性往往是透明的，更亲水，并且在原位降解速度快。

  1. 如果不立即使用，可以将薄膜切割成型并在室温下储存 2 年或更长时间。
    注意： 丝膜也可以浇铸到带图案的表面上以复制表面形貌，通常使用硅橡胶或类似材料来轻松去除丝材料。此外，由于潜在的材料浮力，可能需要使用加权方法来保持薄膜浸没在介质中。

4.  3D Silk Sponge Scaffolds： 这种处理方法为体外和体内应用或原位植入创建 3D 多孔支架。支架孔径和可降解特性也可以使用以下方法进行调整。

A. 将蚕丝溶液等分到所需的成型容器中，建议使用聚四氟乙烯，以便于去除材料。

B. 对于每个正在制备的样品，称量必要量的盐，以保持盐与丝的重量比为 25:1。
注意：对孔径的控制取决于所选的氯化钠（盐）晶体尺寸。如果确定的孔径大小，请使用不锈钢筛网以产生均匀的盐晶体大小。对于 750 µm 及更大的盐颗粒，建议将蚕丝溶液浓缩至 8% 或以上。

C. 在旋转模具的同时将盐缓慢添加到蚕丝溶液中，以使盐添加均匀。确保通过轻微搅拌或敲击表面小心去除因材料移位而形成的气泡。

D. 盖上模具，让溶液在室温下静置 1-2 天，以形成丝质支架。

E. 支架形成后，取下模具盖，将样品放入 2 升 DI 烧杯中，然后放在搅拌板上。

F. 48小时内每8-12小时换一次水。

H. 洗涤期结束后，从模具中取出形成的支架并放入最后的去离子水中冲洗 24 小时，以确保*去除残留的盐分。

I. 支架可在去离子水中 4 °C 储存或在室温下干燥直至需要。

J. 脚手架可切割成所需尺寸并在使用前进行蒸汽灭菌

5. 3D Silk Hydrogels： 这种加工方法可用于生产丝水凝胶，用作可注射生物材料、体外培养和体内使用。

A. 将 5% 的丝溶液放入所需的成型容器或小瓶中。

B. 用胶带将容器或小瓶垂直固定到实验室涡旋仪上。

C. 以最大转速涡旋溶液几分钟。这些参数需要针对给定的丝溶液体积和模具几何形状进行优化。

注意：例如，将 1 mL 的丝溶液移液到玻璃小瓶中，并在 3,200 RPM 下涡旋约 7 分钟。溶液应增加浊度，表明胶凝过程已开始。

注意：一旦溶液被涡旋，在凝胶化完成之前不要将溶液转移到第二个容器中。

D. 将涡旋丝/成型容器/小瓶置于 37 °C 培养箱中过夜，以加快凝胶时间。

E. 丝水凝胶只要保持水分并储存在 4°C 的去离子水中，就可以用于未来使用。