paratechs 50010说明书
Nitrate Reductor Kit 50010
50010
该设备可用于使用单个一次性微孔板分析生理液中的硝酸盐作为亚硝酸盐，用于还原过程和 Griess 反应比色测定。Reductor 在涉及体内一氧化氮产生的生物医学研究中具有广泛的应用。
该设备还应用于农业研究、土壤测试和环境监测。
昂贵的一次性硝酸盐分析套件被可重复使用的设备取代，适用于分析数千个样品。
常规执行 ELISA 测试程序的实验室应该已经拥有必要的设备和用品，并且只需要购买 Reductor 即可获得比几乎任何其他分析系统更有效地执行硝酸盐分析的能力。
几乎可以在任何样品基质中成功分析硝酸盐。
引用出版物中描述的标准添加方法协议允许在一次操作中准确建立水标准与统计得出的样品浓度的关系。因此可以很容易地确定对给定矩阵的方法的绝对准确度的评估。
使用其他市售硝酸盐分析套件时，每次分析的费用从几美元减少到使用 ParaTechs Reductor 时只需几美分。
不再需要昂贵的专用仪器，例如连续流分析仪。除了准确的移液技能外，执行分析只需要很少的专业知识。
减速器没有活动部件，分析不需要启动时间。试剂制备简单，可长期稳定使用。
使用多个还原器，用于硝酸盐分析的每日实验室吞吐量仅受应用于该任务的个人数量的限制。
硝酸盐还原剂说明
有可能的使用
ParaTechs Nitrate Reductor 旨在促进对各种样品基质中的硝酸盐进行分析，包括血清、尿液、天然水以及土壤和植物组织的提取物。该装置由 96 个单独的镀铜镉针组成，用于在一次性微孔板的所有孔中同时将硝酸盐还原为亚硝酸盐。还原完成后，加入 Griess 试剂，并使用酶标仪进行最终比色测定。
需要分析仪器
可调谐酶标仪(或带有 540 nm 滤光片的仪器)；超声波清洗机；滴定板摇床；单道和多道移液器；酸碱度计；涡流混合器。当使用集束管 (Fisher Scientific) 制备样品进行分析时，离心机(例如，带有 A-2-DWP 转子的 Eppendorf 5810 型)对于某些应用也是不可少的。
重要的
ParaTechs Nitrate Reductor 用作一组 Cu-Cd 微型电池，具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐所需的电压。然而，在镀铜过程中，Reductor 将无法正常工作，并且使用高浓度硝酸盐激活以增加反应表面积已成功完成。每个新的 Reductor 都在我们的实验室进行了部分预处理，但仍 必须在酸性清洁溶液中超声处理 2 分钟，然后在进行校准检查之前用高浓度的硝酸盐进一步活化 (见下文)。初始调节后，随着铜涂层变得更加稳定，还原剂的性能将有所提高。然而， 每次使用 Reductor 时都必须执行 60 秒的超声处理步骤。 镉针上的活性还原位点将被氧化镉阻塞，因为在每次使用后让还原剂干燥。
处理
Reductor 可重复用于数千个样品，而不会显着降低效率。多次使用 (40-60+) 后，镉针会在液-气界面处被腐蚀，并且针可能会在超声波清洗过程中开始折断。 建议在每次销售时购买两个减速器，以便始终提供备用设备. 还原器已在我们的实验室进行了预处理，但是，在首使用之前，必须在硫酸铜的盐酸溶液(2 mL 2.0% CuSO4/175 mL 1.0 M HCl)中超声处理 2 分钟以激活还原器。该溶液可以装在提供的可密封塑料盒中，该塑料盒装在超声波清洁器内。激活过程用于增加减速器引脚的反应表面积并启动镀铜过程。超声处理后，Reductor 用 DI 水冲洗，用纸巾擦干，然后安装到含有 20 µL 200 µg/ml 硝酸盐-N 溶液和 200 µL 标准 pH 8.5 氯化铵缓冲溶液的微孔板上(见下文)。然后将该组件摇动一小时。下一个，用 DI 水*冲洗 Reductor，然后放回酸洗溶液中 60 秒。最后，将还原器冲洗干净，吸干水分，然后放入提供的包含 pH 8.5 氯化铵缓冲液的托盘 (Nunc Omintray) 中。然后执行校准检查。
校准检查
在开始实际样品分析之前，应验证每个新 Reductor 的精度。在归约过程中，所有引脚的行为都应相同。应使用基本分析程序(如下所述)分析 96 份相同标准溶液(即 5.0 µg/mL NO3-N)。所有产生的光密度都应在移液误差范围内(即 ±3%)。 注意：当使用多道移液器添加标准溶液时，吸头组应在使用前润湿并至少更换两次，以避免引入移液错误。
分析前样品制备
可以使用 Reductor 分析具有简单基质(例如天然水或土壤的氯化甲提取物)的样品，而无需考虑样品制备。只需将校准标准的基质与样品基质匹配并提供足够的还原时间。然而，在分析具有复杂基质的样品时，不可能与水标准品进行密切匹配。例如，生理液体和一些含有低水平硝酸盐的植物组织提取物不能被充分稀释以抵消基质成分对还原过程的影响，或在还原成亚硝酸盐完成后对格里斯反应化学的影响。因此，需要在开始分析之前尽可能地去除这些物质。Somogyi试剂(NaOH/ZnSO4)的使用，如下所述，可能有助于缓解此问题。在说明末尾的参考资料中可以找到对这些问题的更完整讨论。
分析试剂 (有关具体制备说明，请参阅下面的参考资料。)
1. 酸洗溶液 2 mL 2% CuSO4·5H2O 的 175 mL 1M HCl。
2. 1% NH4Cl 缓冲液 pH 8.5。
3. 1% NH4Cl 缓冲液，pH 10.0。
4. Griess 试剂库存#1。去离子水中的 0.1% N(1-萘基) 乙二胺2盐酸盐 (NED)。
5. Griess 试剂库存#2。1.0% 磺胺的 3M HCl 溶液。
6. Griess 试剂库存#3。1.0% 磺胺的 6M HCl 溶液。
7. Somogyi 试剂溶液#1。0.300M NaOH。
8. Somogyi 试剂溶液#2。5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 在 DI 水中的溶液。
9. 经认证的 1000 mg/L NO3-N 储备溶液(Fisher Scientific)。
基本分析程序
1. 每次使用Reducor都必须执行此步骤。 Reductor 用 DI 水冲洗，放入酸洗液中，超声处理约 60 秒以去除表面氧化。
2. 然后用 DI 水冲洗 Reductor，并在纸巾上吸干。此外，在分析过程中，附着在设备底部的任何液体都可能会渗入样品中，因此必须使用 Q-tip 或折叠纸巾将其清除。然后将该装置放置在包含标准 pH 8.5 氯化铵缓冲溶液的托盘 (Nunc Omnitray) 中，小心仅将针浸没，同时保持底部干燥。
3. 对于水样或土壤的 KCl 提取物，在样品基质中制备标准品。20 µL 等分试样通常会产生 0-5 µg/mL NO3-N 范围内的线性校准曲线。但是，可以根据需要通过改变等分体积来调整范围。
4. 开始分析时，通常将 20 µL 等份样品移液到微孔板 (Nunc) 中，然后加入 200 µL pH 8.5 氯化铵缓冲液。
5. 将微孔板放在滴定板振荡器上。将 Reductor 从托盘中提起，在纸巾上吸干，并用锁定销固定在微孔板上。调整摇床速度设置，使不会发生溢出(即 6.5)。然后通过摇晃约 60 分钟将硝酸盐定量还原为亚硝酸盐。
6. 当样品摇晃时，Griess 试剂可以通过混合等体积的储备溶液#1 和#2 来制备。
7. 振荡间隔后，将 Reductor 从微孔板中提起并用 DI 水*冲洗。如果要立即重新使用 Reductor，则可以重复清洁和重新激活程序。否则，应让减速器在纸巾上晾干。
8. 然后将 60 µL 混合的 Griess 试剂加入到含有样品和校准标准品的微孔板中，并置于滴定板振荡器上 5 分钟以完成显色。
9. 最后，通过在酶标仪上测定样品和标准品在 542 nm 处的光密度来完成分析。
使用 Somogyi 试剂修改样品基质
对于血清、尿液或高度着色的植物组织提取物等基质复杂的样品，可使用 Somogyi 试剂(NaOH/ZnSO4)与 Zn(OH)2 共沉淀，消除样品基质中的许多干扰物质。对基本程序的进一步修改，例如将还原过程中使用的缓冲溶液的 pH 值提高到 10.0，以及增加混合 Griess 试剂中的磺胺浓度，也将有助于减少干扰。有关使用标准添加方法的程序验证协议的讨论，请参阅参考资料。
1. 如果有配备合适转子的离心机(见上文)，使用 1.2 mL 集束管进行分析前基质修饰是有效的。首先，将适当数量的空管放置在集束管架中；然后将 300 µL Somogyi Reagent Solution #1 (0.300 M NaOH) 添加到每个试管中。接下来，添加 150 µL 样品，并通过将液体吸回移液器吸头并排出至少两次来与 NaOH 混合。然后使用单通道移液器添加 300 µL Somogyi 试剂溶液 #2(5.00% w/v 的 ZnSO4·7H2O 的去离子水溶液)，并立即涡旋每个簇管。这建立了 5 的稀释系数。
2. 将装满的簇管架置于冰箱或冰浴中 10 分钟，让共沉淀反应发生。然后将簇管架组件以 3700 rpm(最大速度)离心 20 分钟。得到的上清液应该是透明的，没有硝酸盐的损失。
3. 校准标样在适当范围内的去离子水中制备。对于血清，典型的操作范围是 0-2 µg/mL NO3-N(即 0-143 µM)。将处理过的血清样品和校准标准品的 50 µL 等分试样移液到 Nunc 微孔板中，并添加 170 µL pH 10 氯化铵缓冲液。
4. 与 pH 10 的氯化铵缓冲系统一起使用的 Griess 试剂是通过将 5 mL 等分的储备溶液 #1 和 #3 添加到预先称重的 200 mg 磺胺中来制备的。可以使用声处理来溶解固体。
5. 还原过程和最终的比色分析如前所述使用 60 分钟的还原时间进行。
烟草植物组织硝酸盐分析特别说明
烟草植物含有(也许)数百种可溶性化合物，这些化合物可能在接近中性的 pH 值下与亚硝酸盐发生反应。这提出了所有使用镉还原的硝酸盐分析技术的共同问题。ParaTechs 镉还原剂在分析过程中将硝酸盐 (NO3) 还原为亚硝酸盐 (NO2)，然后这种 NO2 可能与烟草中发现的可溶性化学物质反应形成不会产生颜色响应的化合物，因此不会测量 NO2 . 可以通过将氯化铵 (NH4Cl) 缓冲液的 pH 从 8.5 提高到 10.0 来最小化这个问题。在较高的 pH 值下，亚硝酸盐的反应性较低，因此在还原剂就位时，大部分 NO2 是稳定的。然而，一旦加入 Greiss 试剂，pH 就会降至 0 以下。
Greiss 反应分两个阶段进行。在第一阶段，NO2 与磺胺反应，然后该中间产物与 0.1% N-(1-萘基)乙二胺2盐酸盐 (NE) 试剂反应形成颜色响应。在分析烟草组织(和其他植物组织)时，我们建议在混合显色试剂中添加超出通常推荐量的额外磺胺。这增加了 NO2 离子在与一些其他化合物发生反应之前遇到磺胺的统计概率。通常，我们在 10 mL 混合 Greiss 试剂中称重 200 mg 额外的磺胺。这导致溶液接近饱和，并且已发现显着增加计算的硝酸盐水平。请注意，要使用的磺胺原液是用 6 N HCl 而不是 3 N HCL 配制的。
附加信息
Nitrate Reductor 套件不包括超声波清洁器。我们发现“Gemoro 1.2 Quart Ultrasonic Cleaner”品牌是用于在两次使用之间清洁减速器的有效仪器，并且与提供的酸洗溶液容器兼容。
