polylc 聚磺乙基简介

polylc 聚磺乙基简介

聚磺乙基 A™

- 用于肽的阳离子交换-

这种强阳离子交换 (SCX) 材料是专门为多肽的 HPLC 开发的。在 pH 2.7-3.0 时，肽会失去 (-) 电荷并具有净 (+) 电荷。因此，PolySULFOETHYLA™是反相 (RPC) 的通用替代品，通过电荷差异而不是极性来分离肽。与其他基于磺丙基 (SP-) 基团的 SCX 材料相比，PolySULFOETHYLA™是异常亲水的。这最大限度地减少了与肽的疏水相互作用，具有高回收率和更少的峰拖尾。容量也很高，可以更好地保留和分离胰蛋白酶消化物中的弱碱性肽。这种离子交换材料的容量是同类 RPC 柱的 4 倍。因此，离子交换应该是多步纯化的第一步。将聚磺乙基 A™ 用于：

1) 多肽混合物的多维 HPLC，例如 蛋白质组学分析中的胰蛋白酶消化物（包括 iTRAQ® 和 ICAT®* 反应产物）。

2) 从天然产物中分离肽。

3) 合成肽的QC和纯化。

4) 从胰蛋白酶消化物中选择性分离二硫键连接的肽、磷酸肽和 C 端片段。

5) 肽消化物图谱（胰蛋白酶、V8、CNBr 等）。

蛋白质也可以在PolySULFOETHYL A™色谱柱上运行；在 pH 值为 3 时，几乎可以保证保留。一个例子是在以亲水相互作用(HILIC) 模式操作的 PolySULFOETHYL A 色谱柱上分析肺表面活性剂蛋白。

肽应用的标准材料是 300-Å，3- 或 5-µm。200-Å 材料的容量增加约 25%，是 iTRAQ® 反应混合物的磷酸肽分离和分级分离的优选。对于蛋白质，使用 1000-Å 材料或 3-µm、1500-Å 材料。

蛋白质组学

胰蛋白酶消化物的 SCX-RPC：  没有单一的分析方法足以识别一个非常大的集合中的每个蛋白质。一种广泛使用的方法（自下而上"蛋白质组学）是用胰蛋白酶消化混合物中的所有蛋白质，并将所得肽分成足够小的组，以便通过 MS/MS 或 QTOF-MS 进行鉴定。对于少于 200 个肽段的样品，反相 HPLC 通常可以提供足够的分辨率，但较大的样品必须首先通过补充方法分成子集。实现此目的的最佳方法是使用强阳离子交换 (SCX)通过荷质比的差异将消化物分成几部分。然后可以通过 RPC-MS 分别分析每个 SCX 馏分。该序列已用于鉴定样品中多达 12,000 个肽段。我们的聚磺乙基天冬酰胺™材料是好的，大多数蛋白质组学实验室都在使用。最好在 pH 2.7-3.0 的盐梯度下进行，此时羧基失去负电荷，几乎所有肽都带净 + 电荷。在典型的复杂胰蛋白酶消化中，大约 65% 的肽具有 +2 的净电荷（由于碱性 N 末端和 C 末端的 Lys- 或 Arg-）。线性盐梯度会导致这些洗脱物聚集在几个馏分中，从而破坏了色谱第二维的目的。相反，使用 2 段线性梯度洗脱色谱柱；在大部分梯度时间内使用浅梯度（至约 180 mM 盐）以分散 +1 和 +2 肽，并使用陡峭梯度至约 0.5 M 盐以洗脱 +3 和 +4 肽。

在线与离线 SCX 分馏：PolySULFOETHYL A™填充毛细管可以通过增加盐浓度的步骤进行洗脱，每个馏分进入脱盐 RPC 捕集柱或直接进入 RPC 毛细管。这种安排通常称为MuDPIT。另一种方法是离线收集馏分，然后将它们分别注入 RPC 毛细管（“分离的MuDPIT "）。
在线优势：更容易处理极小样本并实现自动化。
离线优势：
1) 可以用更简单的设备进行。
2) 流动相可以含有 20-25% ACN，可以在 RPC 步骤之前去除。这提供了更尖锐的峰。结果：更高百分比的肽在单个收集的级分中洗脱，而不是在两个相邻级分之间分离（在有利的情况下，> 75% 的总肽在真正复杂的胰蛋白酶消化物中）。这增加了肽段鉴定的成功率，因为您更有可能在单个部分中获得可检测量（~ 15 fmol）的低丰度肽，并且不太可能与来自高丰度的肽共享该部分蛋白质（可以抑制其在 MS 步骤中的电离）。
3) SCX 色谱柱可以比 RPC 毛细管大。这允许加载更多样品，从而更有可能检测到 > 15 fmol 的每种肽。它还允许使用更快的流速。这有助于收集大量馏分（在某些实验室多达 100 个）。这反过来又增加了识别低丰度肽的机会，因为它们不太可能与高丰度肽共享一部分。例如，甘等人。( Proteomics 5 (2005) 2468) 通过收集 40 个 SCX 级分鉴定出比收集 25 个 SCX 级分多 2.8 倍的蛋白质。
4) 可以使用线性梯度代替阶梯梯度。这增加了分辨率。

结论：离线馏分收集是*的。Kevin Blackburn (NC St. U) 表示*，他通过离线馏分收集识别出的肽比在线多 3 倍，所有增加的肽都代表低丰度的肽。
*（ASMS '00 和 '01）。

完整蛋白质的预消化分馏：这在以下几种情况下非常有用：
1) 样品中的蛋白质太多，即使是 SCX-RPC 的 2-D 组合也不足以充分分馏胰蛋白酶消化物以识别低丰度肽。
2) 样品中含有一些丰度比其他蛋白质高得多的蛋白质。将它们收集在它们自己的部分中将排除它们的胰蛋白酶片段掩盖来自低丰度蛋白质的肽。请参见下面的 THP-1 单核细胞示例。
3）虽然蛋白质的数量有限，感兴趣的蛋白质丰度低，如果在消化前不与高丰度蛋白质分离，就会被掩盖。参见组蛋白 H4 和 H1.5 的示例。
4) 在消化前将蛋白质分配到组分中增加了通过一种以上肽识别特定蛋白质的机会。请参见以下示意图：

用于此目的的通用方法包括疏水相互作用 (HIC) 和离子交换 (IEX) 色谱法。HIC 是一种通过疏水性差异分离水溶性蛋白质的好方法 [下]。与反相色谱不同，它是一种非变性模式。然而，疏水蛋白很难在 HIC 中保持在溶液中。

相比之下，IEX 可以在流动相中使用有机溶剂进行，使其与所有蛋白质具有前瞻性兼容。参见蛋白质与有机溶剂的离子交换。

串联使用阴离子交换柱和阳离子交换柱会产生保留所有蛋白质的混合床排列。下面的示例是 THP-1 单核细胞沉淀的粗裂解物，使用PolyCAT A™和PolyWAX LP™色谱柱获得。具有挥发性盐的梯度是可能的。

膜蛋白的HILIC：HILIC 对膜蛋白非常有效，如下例所示。有时可以使用挥发性溶剂。组蛋白最好在HILIC 模式下使用PolyCAT A™色谱柱进行分离。

从胰蛋白酶消化物中分离磷酸肽和其他类型的肽：由于 N 端和 C 端的 Lys 或 Arg 残基，典型的胰蛋白酶肽在 pH 2.7-3.0 时具有 +2 的净电荷。磷酸基团的连接将肽的净电荷降低至+1。因此，最早洗脱的 SCX 级分富含磷酸肽，以及 C 端和封闭的 N 端片段。PolySULFOETHYL A™的 200-Å 孔径版本比通常用于蛋白质组学的 300-Å 材料具有更高的表面积，并且可以合理地*地将 +2 肽从 +1 肽中拉出 [下图]。博索莱尔等人。（美国国家科学院院刊 101(2004) 12130) 已经使用这种方法从 HeLa 细胞裂解物的胰蛋白酶消化物中鉴定了 2000 多种磷酸肽。在各种研究中，一个非常复杂的胰蛋白酶消化物中大约 20-30% 的磷酸肽在这个 +1 窗口中被洗脱。最近对这种方法的一个很好的研究是：JC Trinidad等人，Mol。细胞。蛋白质组学5 (2006) 914。

在另一个交联两个 +2 肽会产生净电荷为 +4 的肽。因此，在非还原的胰蛋白酶消化物中，二硫键连接的肽比大多数其他肽的洗脱时间明显晚。该方法已被用于选择性地隔离它们。

膜和全细胞沉淀的问题：
1) 溶解样品。
2) 从所得溶液中除去脂质。
3) 在随后的分馏过程中将膜和结构蛋白保持在溶液中。

此类样品可在室温下用 4:1 的 HFIP [纯] 和浓溶液在几分钟内溶解。甲酸 (96-98%)。膜蛋白也可以用丙醇或含有 HFIP 的乙腈提取（参考文献：J. Carroll 等人，PNAS 103 (2006) 16170）。这些溶剂避免了去污剂对下游分析方法的干扰。所得溶液中的脂质可以通过 HILIC 模式下的 SPE 小柱去除；例如，item# SPEHY1203、TT200HEA 等。不保留脂质（以及盐和去污剂），但保留蛋白质和肽。然后可以通过逐步增加水溶液来洗脱蛋白质和肽。要在 IEX-HPLC 期间保持蛋白质在溶液中，请使用 NaClO 4用于梯度并在流动相中包括以下内容：50 mM HFIP、20% ACN 和 20% PrOH。在情况下，使用 35% 的 ACN 和 35% 的 PrOH。或者，根据上述膜蛋白示例，在 HILIC 模式下使用PolyHYDROXYETHYL A™ 。
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ICAT®；iTRAQ®；MuDPIT :
ICAT: 如果您可以通过鉴定 2 或 3 个胰蛋白酶片段来确定蛋白质的存在，那么鉴定其余部分是多余的。ICAT 的“AT"部分消除了蛋白质中的大部分胰蛋白酶片段，从而可以从复杂的混合物中识别出更多的蛋白质。在亲和素柱亲和纯化之前，通常在PolySULFOETHYLA™上通过 SCX 对完整的消化物进行分级分离。这可以清理样品并消除多余的 ICAT 试剂，否则可能会使亲和素的结合能力饱和。
iTRAQ：这有助于测量相对丰度，但不一定以 ICAT 的方式简化混合物。与 iTRAQ 试剂反应后，确保将 pH 值降至 3.0 或更低，并对混合物进行脱盐，以便在 SCX 中获得良好的保留。
MuDPIT：参见上面关于在线与离线方法的讨论。

蛋白质组学策略中的常见缺陷：
1) 未能消除脂质：这些会阻塞 RPC 柱并通常会产生干扰。使用 SPE-HILIC 小柱去除它们，或者使用含有 > 40% 有机溶剂的流动相进行离子交换。
2) 在胰蛋白酶消化过程中使用尿素、SDS 或 Gd.HCl：这些与 RPC 和/或 MS 不兼容。改用 30% 的 PrOH。参考：WK Russell等人  化学。73 (2001) 2682。
3) 胰蛋白酶化或 iTRAQ 反应后未能调节 pH：胰蛋白酶化和 iTRAC 衍生化在 pH 8 下进行，而随后的 SCX 在 pH 2.7-3.0 下进行。未能调整 pH 值将导致样品洗脱到空体积中。如果可能，使用 NH 4 HCO 3作为胰蛋白酶化缓冲液而不是 Tris，因为它可以通过冻干法消除。
4) 样品太咸：如果使用 SpeedVac® 去除 NH 4 HCO 3，将样品连续干燥 3 次。对 iTRAQ 反应产物进行脱盐比仅用 SCX 流动相稀释它们要好。
5) TFA 或 HFBA 的使用：一些作者建议在 SCX 的样品溶剂或起始流动相中使用它们。不！胰蛋白酶肽通常不保留在此类溶剂中。使用 5 mM KH 2 PO 4或 0.1% 甲酸或乙酸。6) SCX 色谱柱或毛细管过载： PolySULFOETHYLA™
色谱柱 每次进样推荐的最大肽装载量如下：0.30-mm id，25µg；1.0 毫米内径，250µg；2.1 毫米内径，1.0 毫克；4.6 毫米内径，5 毫克。一些组超过这些水平高达 6 倍。这节省了劳动力并产生了更浓缩的馏分。问题：

a) 列通常持续 1/6 的时间。
b) 峰更宽。这意味着在每个收集的部分中会有更多的肽。RPC 毛细管可能过载，导致识别的肽百分比较小。

结论：为您的样品使用足够大的 SCX 色谱柱。

含 2µm 颗粒的色谱柱 （孔径选项：-01、-03、-10）

具有 3µm 颗粒的色谱柱 （孔径选项：-006、-01、-03、-05、-10、-15）

具有 5µm 颗粒的色谱柱 （孔径选项：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）

具有 3µm 颗粒的毛细管* （孔径选项：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**

带有 5µm 颗粒的毛细管* （孔径选项：-006、-01、-02、-03、-05、-10、-15）**

散装材料 - 按克计价

固相萃取柱 - 10 包

项目编号	颗粒/孔径	价格
SPEHY1201	12µm, 100Å	110.00
SPEHY1203	12µm, 300Å	110.00
SPEHY1215	12µm, 1500Å	110.00
SPEHY2001	20µm, 100Å	110.00
SPEHY2003	20µm, 300Å	110.00

 

保护墨盒 - （注意：需要可重复使用的支架。请参阅下面的列表）

墨盒尺寸	项目编号	价格/克
10×1.0mm	GC1-HY02--	100.00
10×1.0mm	GC1-HY03--	85.00
10×1.0mm	GC1-HY05--	75.00
10×2.0mm	GC2-HY02--	100.00
10×2.0mm	GC2-HY03--	85.00
10×2.0mm	GC2-HY05--	75.00
10×3.0mm	GC3-HY02--	100.00
10×3.0mm	GC3-HY03--	85.00
10×3.0mm	GC3-HY05--	75.00
10×4.0mm	GC4-HY02--	100.00
10×4.0mm	GC4-HY03--	85.00
10×4.0mm	GC4-HY05--	75.00
20 x 4.0mm	GC4-HY03---2	90.00
20 x 4.0mm	GC4-HY05---2	80.00
上面的支架 （CPI 细节；内螺纹入口，外 螺纹出口）	DGCH10 直接保护墨盒支架	60.00
上面的支架 （CPI 细节；内螺纹入口，内 螺纹出口）	IGCH10 Inline Guard 墨盒支架	60.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY03--	175.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY05--	160.00
10 x 10mm （需要 CH10 支架）	110GCHY12--	80.00
持有者	CH10	150.00
30 x 21.0mm	（问）	（问）